糖尿病肾脏疾病（Diabetic Kidney Disease,DKD）是终末期肾脏病（End-Stage Renal Disease,ESRD）的重要病因之一,在包括美国在内的许多国家中高居ESRD病因构成的首位。然而,大量的临床研究在长期随访过程中发现,并非所有糖尿病（Diabetes Mellitus,DM）患者都会进展至糖尿病肾病（Diabetic Nephropathy,DN）阶段。造成肾脏微血管并发症异质性的原因很多,涉及基因遗传、环境因素、慢性肾脏病基础、血压和血糖等并发症控制情况等,具体发病机制目前尚未完全阐明。以血糖为例,众所周知血糖控制不佳是蛋白尿发生、DN进展的危险因素,但仍有部分患者在强化血糖控制后进入DN。因此,寻找敏感、能准确预测早期DN的生物标志物具有十分重大的意义。微量白蛋白尿（Microalbuminuria,MAU）是临床仍在沿用的DM微血管并发症诊断标志物,近些年来对其质疑的声音越来越高——许多患者在发生肾功能不全时并未经历MAU增加、显性蛋白尿这一阶段,或在发生MAU时即已合并肾功能不全。在英国前瞻性糖尿病研究（UKPDS）中,发生肾功能下降的患者中61%无MAU病史,39%病程中始终尿蛋白排泄正常;而试验中发生蛋白尿的患者中仅24%后续合并肾功能不全。换而言之,尿白蛋白排泄率的增高并非GFR下降的前期必经阶段,并不意味着患者会进展至肾功能损害阶段。因此,迫切需要寻找新的生物标记物以预测DN发生的风险。围绕这一主题,人们开展了大量研究以筛选新的分子指标,其中,糖原合成酶激酶3（Glycogen Synthase Kinase3,GSK3）逐渐受到关注。GSK3是一种高度保守、广泛表达于真核生物细胞的多功能丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,因其作为胰岛素信号通路的重要效应器,调控糖原合成而得名。深入研究后发现,GSK3可调节体内多条信号通路,进而参与炎症、免疫调节、胚胎发生、组织损伤、修复与再生等多种细胞过程。在体内,GSK3有α和β两种亚型,亚型之间存在显著的组织差异性分布。在肾脏,GSK3β呈优势表达,且在小球和小管中均有表达。在多种以蛋白尿为主要表现的肾小球疾病中,肾脏GSK3β过度活化被视为重要发病机制之一。本课题组的前期研究提示,在阿霉素肾病、肾毒血清肾炎等多个模型中,靶向抑制GSK3β（包括基因敲除和特异性抑制剂SB216763）可发挥足细胞保护作用,减少蛋白尿。但GSK3β在DN肾组织的表达、活性变化尚不明确,其是否参与蛋白尿、病理损伤的发生也有待确认。因此,本课题中,我们分别在DN动物模型、体外培养肾脏固有细胞及DN患者肾脏病理标本中,观察GSK3β表达及活性的改变,并通过回顾性研究,结合患者临床资料,判断GSK3β过度活化能否作为比MAU更早的预测早期DN进展的生物学标记物。第一部分 糖尿病小鼠GSK3β表达与肾脏损伤之间的关系目的在DN小鼠模型中,检测肾脏GSK3β、磷酸化活性GSK3β（p-GSK3β-Y216）的表达,并分析GSK3β表达异常与蛋白尿、肾脏组织损伤之间的关系。方法db/db小鼠中,定期检测一般情况、体重、血糖、尿白蛋白肌酐比值（Albumin-Creatinine Ratio,ACR）。根据实验需求分别于 10 周、14 周、18 周、22周分批处死小鼠,取肾组织备用。以db/m小鼠为对照。1.采用免疫组织化学方法检测GSK3β和p-GSK3β-Y216在肾脏的蛋白表达和定位情况,免疫印迹方法测定不同周龄时两组小鼠肾组织GSK3β和p-GSK3β-Y216的蛋白表达情况。2.采用PAS染色法对比观察不同周龄小鼠肾脏病理损伤情况。3.采用免疫荧光法观察细胞外基质成分——纤维连接蛋白（Fibronectin,FN）在两组小鼠肾脏中的表达和定位情况。免疫印迹法检测两组小鼠肾脏FN和Ⅳ型胶原（Collagen Ⅳ,Col Ⅳ）的表达。4.对两组小鼠肾小球GSK3β和p-GSK3β-Y216的蛋白表达量与尿蛋白排泄率、肾脏FN表达之间的关系进行相关性分析,以判断GSK3β过表达或活性异常是否与DN进展相关。结果1.两组小鼠一般情况对比:db/db小鼠明显肥胖,体重增加,肾重/体重比下降,血糖升高,10周时尿ACR即已明显升高（P<0.05）。2.从表达定位来看,GSK3β和p-GSK3β-Y216在肾小球足细胞、系膜细胞和肾小管上皮细胞等多种肾固有细胞中均有表达。小球和小管间染色对比无明显差异。在DN损伤的较早阶段——10周和14周时即可观察到GSK3β过度激活,表现为p-GSK3β-Y216的染色增强。3.免疫印迹结果显示,随周龄延长,db/db小鼠GSK3β和p-GSK3β-Y216表达逐渐增加,与免疫组化染色结果一致。db/m小鼠该趋势不明显。4.Image J半定量分析显示,GSK3β和p-GSK3β-Y216的蛋白表达量与尿蛋白排泄率呈正相关（P<0.05）。5.随周龄延长,db/db小鼠肾脏病理损伤逐渐明显,FN荧光染色增强,免疫印迹法显示肾组织FN和Col Ⅳ的表达不断升高,组间比较有统计学差异（P<0.05）。6.Image J半定量分析显示,GSK3β和p-GSK3β-Y216的蛋白表达量与尿蛋白排泄率、FN的表达呈正相关（P<0.05）。结论1.DN小鼠模型中,肾脏存在GSK3β过度活化。2.DN小鼠模型中,推测Y216位点磷酸化是导致DN早期GSK3β过度活化的主要原因。3.DN小鼠早期GSK3β表达异常与尿蛋白排泄、肾脏组织损伤之间呈正相关,提示GSK3β过度活化可能是DN损伤进展的高危因素。第二部分 高糖下肾脏固有细胞GSK3β表达与细胞损伤之间的关系目的体外培养足细胞、系膜细胞和肾小管上皮细胞,并分别给予高糖、甘露醇刺激,观察不同状态下细胞形态、标志蛋白、GSK3β的表达及活性改变。通过RNA干扰、转染GSK3β过表达质粒两种途径观察不同培养条件下调节GSK3β对肾固有细胞的影响,以明确GSK3β是否介导DN时细胞损伤。方法1.体外培养条件永生化小鼠足细胞、小鼠系膜细胞和小鼠肾小管上皮细胞,分为正常糖组（NG）,高糖组（HG）和高渗组（MG）。2.免疫荧光共染观察足细胞、系膜细胞和肾小管上皮细胞GSK3β和p-GSK3β-Y216的表达和细胞内定位情况。免疫印迹法测定三种细胞中GSK3β和p-GSK3β-Y216的蛋白表达量并进行定量分析。3.免疫荧光法观察足细胞标志蛋白F-actin和Synaptopodin（SYNPO）的表达,系膜细胞FN和小管上皮细胞ZO-1的表达和定位情况。免疫印迹法测定足细胞SYNPO、系膜细胞FN和小管上皮细胞ZO-1的蛋白表达情况并进行定量分析。4.为判断GSK3β过表达或活性异常是否与细胞损伤相关,对不同细胞GSK3β和p-GSK3β-Y216的蛋白表达量与细胞标志蛋白之间的关系进行相关性分析。5.上述细胞分别转染入空载体（EV）、GSK3β S9位点持续激活（S9A）质粒,免疫荧光染色测定质粒转染效率,免疫印迹法观察GSK3β持续激活对细胞标志蛋白表达的影响。6.上述细胞分别转染入scramble siRNA和GSK3β siRNA,免疫印迹法观察GSK3β沉默后足细胞SYNPO、系膜细胞FN和小管上皮细胞ZO-1的表达情况。结果1.高糖刺激下,足细胞F-actin、SYNPO表达减少,GSK3β和p-GSK3β-Y216.的表达增多。2.高糖刺激下,系膜细胞FN表达增加,GSK3β和p-GSK3β-Y216的表达增多。3.高糖刺激下,肾小管上皮细胞ZO-1表达下降,GSK3β和p-GSK3β-Y216的表达上调。4.正常糖培养基生长条件下,转染GSK3β S9位点持续激活（S9A）后,足细胞SYNPO表达明显减少,系膜细胞FN表达明显增加,同时肾小管上皮细胞ZO-1表达降低。5.转染入GSK3β siRNA后可明显缓解高糖条件下的细胞标志蛋白表达异常,表现为GSK3β表达受抑伴足细胞SYNPO和肾小管上皮细胞ZO-1表达上调,系膜细胞FN表达减少。结论1.高糖刺激下,包括足细胞在内的多种肾脏固有细胞存在GSK3β过度激活和细胞损伤。2.GSK3β持续激活后,加重细胞损伤,提示GSK3β过度活化是导致DN状.态下肾脏细胞损伤的重要途径之一。转染入GSK3β siRNA后可明显缓解高糖条件下的细胞标志蛋白表达改变,提示GSK3β过度活化是介导DN时细胞损伤的必需条件。第三部分糖尿病患者尿脱落细胞GSK3β表达与肾脏损伤之间的关系目的1.观察不同病理分期（Ⅰ-Ⅳ期）的DN患者肾组织标本中GSK3β蛋白表达、活性改变,分析GSK3β表达异常与肾脏病理损伤之间的关系。2.通过回顾性研究,测定DN进展患者基线尿液中的GSK3β表达、活性改变。结合患者临床资料,判断GSK3β过度活化能否作为比MAU更早、预测DN进展的生物学标记物。方法1.通过Nephroseq数据库（www.nephroseq.org）检索对比DN患者和健康对照肾小球中GSK3β基因的表达情况。2.采用PAS染色法观察不同病理分期DN患者的肾脏改变。免疫组化染色观察GSK3β和p-GSK3β-Y216的表达变化。3.收集DN进展患者临床资料,构建COX多因素模型,分析DM肾脏损伤进展的临床危险因素。4.测定患者基线时尿液脱落细胞中GSK3β和p-GSK3β-Y216的表达。5.建立ROC曲线,分析GSK3β和p-GSK3β-Y216/GSK3β预测DN进展的诊断效能。结果1.与健康群体相比,DN患者肾小球GSK3β基因表达明显升高（P=3.58E-4）2.肾小球足细胞、系膜细胞和小管上皮细胞均为GSK3β和p-GSK3β-Y216阳性表达部位。肾小球、肾小管GSK3β表达无明显差异。3.与正常对照组相比,在DN Ⅰ、Ⅱ期,即可观察到肾脏GSK3β及p-GSK3β-Y216的显著增加。随病理分期加重,DN Ⅰ-Ⅲ期肾小球GSK3β表达逐渐升高,DN Ⅳ期同样呈现GSK3β高表达——与Ⅰ-Ⅱ期相比,差异有统计学意义（P<0.05）,与Ⅲ期对比无明显差异（P>0.05）。在小管间质中,GSK3β的表达随病理分期进展逐渐升高（P<0.05）。随DN病理损伤加重,肾脏GSK3β活性异常增强,表现为p-GSK3β-Y216染色增强。半定量分析结果显示GSK3β、p-GSK3β-Y216与DN病理分期存在正相关。4.依据基线尿蛋白排泄率（Urine Albumin Excretion,UAE）水平将患者分为正常蛋白尿组[16（10.00,25.00）]和微量白蛋白尿组[102.90（53.45,184.92）]。微量白蛋白尿组患者收缩压升高（P=0.023）。除此之外,两组患者基线资料、合并用药方面无差异（P>.05）。5.依据5年后DN是否进展将患者分为两组。与未进展患者相比,DN进展组患者eGFR下降（△eGFR）更为明显（P=0.010）,UAE也显著增加（P<0.001）。此外,进展组患者收缩压水平更高（P=0.001）,血清白蛋白水平相对较低（P=0.029）,ACEI/ARB 使用比例更高（P=0.008）。6.两组患者尿脱落细胞中可检测到GSK3β及其活化形式的表达。与未进展组相比,进展组患者基线即存在GSK3β过度活化,p-GSK3β-Y216/GSK3β比值明显升高（P<0.001）。7.COX多因素回归分析提示,经年龄、性别、BMI等因素校正后,基线GSK3β和p-GSK3β-Y216是2型DM（T2DM）患者肾损伤进展的危险因素。8.与基线UAE相比,基线p-GSK3β-Y216/GSK3β比值的诊断效能更高（P=0.001）。基线p-GSK3β-Y216/GSK3β比值和UAE的最佳临界值分别为1.24和76mg/24h,在此临界值,基线p-GSK3β-Y216/GSK3β比值和UAE预测T2DM肾病进展的敏感性均为69%,特异性分别为87.1%和77.4%。结论1.肾脏GSK3β过度激活与DN发生发展相关。2.尿脱落细胞中p-GSK3β-Y216/GSK3β升高是预测DN进展的良好指标。