Toll样受体（Toll-like receptors,TLRs）是近年来发现的重要天然免疫受体,为Ⅰ型跨膜信号蛋白,能识别不同的病原微生物或其组分,在启动天然免疫反应、激活核转录因子-κB（NF-κB）和介导炎症反应中发挥关键作用,可能是治疗多种急、慢性疾病的新的药物靶标。研究发现TLR3（Toll-like receptor 3）能特异性地识别双链RNA（dsRNA）。呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus,RSV）是世界范围内婴幼儿病毒性下呼吸道感染最重要的病毒病原,也是中老年和免疫缺陷成年人呼吸道感染的重要病原。其核酸类型为单负链RNA,但在病毒复制和转录过程中可合成大量dsRNA,因此,TLR3可通过识别RSV而发挥作用。TLR3和dsRNA结合后可经由髓样分化因子（myeloid differentiation factor 88,MyD88）依赖性和非MyD88依赖性两条途径来诱导NF-κB的激活,促进其转位进入细胞核内和DNA片段结合,启动相应的促炎细胞因子、趋化因子和协同刺激因子表达上调,引起系统性炎性反应。可见TLRs的发现,为研究RSV感染的炎症免疫反应机理提供了新的思路,可能在RSV肺炎的发生发展过程中发挥重要作用。RSV感染的机制十分复杂,目前尚未完全明了,也无理想的治疗药物。因此,深入研究RSV感染的分子机制具有重要医学意义。研究发现,褪黑素（melatonin,MT）具有抗炎、调节免疫和强大的抗氧化作用,能显著降低炎症性损伤,抑制iNOS的产生,与抑制NF-кB有关。MT可能通过直接作用于免疫细胞上的MT受体而发挥作用。在用MT治疗由细菌内毒素诱导的损伤时,能使炎症反应明显减轻。但MT能否对RSV所致炎症免疫反应具有调节作用,其在TLR3信号通路中的作用靶点和作用机制如何,尚不得而知。本文体外和体内实验结合,研究了TLR3活化的信号转导通路参与RSV感染所致炎症免疫反应的分子机制;通过MT对TLR3活化信号转导途径的影响,探讨了药理浓度的MT对RSV所致炎症反应的干预作用及其作用靶点。目的:研究RSV感染后TLR3的表达变化及其介导的下游信号分子改变,探讨TLR3介导RSV感染所致炎症免疫反应的分子机制。用MT预先给药进行干预,通过比较TLR3的表达变化及其介导的下游信号分子改变,研究MT作用的机制;同时观察MT膜和核受体的表达,明确MT是通过与何种受体的结合而发挥作用。方法:1. TLR3介导RSV感染所致炎症免疫反应的体外实验用RSV感染体外培养的RAW264.7细胞,收集不同感染时间点（设RSV感染0,1,4,8,16,24小时组）的细胞和培养上清,用半定量逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测TLR3、MyD88、TNF-α和iNOS mRNA的表达变化,用Western blot检测TLR3蛋白和核内活性NF-κBp65蛋白的表达变化,用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测细胞培养上清中TNF-α蛋白变化。2. TLR3介导RSV感染所致炎症免疫反应的体内实验用RSV滴鼻感染昆明小鼠,收集不同感染时间点（设RSV感染0,1,4,8,16,24小时组或48,72,96小时组）的小鼠血清和肺,用半定量RT-PCR检测肺TLR3、MyD88、TNF-α和iNOS mRNA的表达变化,用Western blot检测TLR3蛋白和核内活性NF-κBp65蛋白的表达变化,用ELISA检测小鼠血清中TNF-α表达变化。3. MT干预的体外实验MT分10-7M、10-6M、10-5M三个浓度组,预先处理RAW264.7细胞,分别收集上述不同感染时间点的细胞和培养上清,用半定量RT-PCR检测TLR3、MyD88、TNF-α和iNOS mRNA的表达变化,并对MT膜受体MT1和MT2以及核受体RORα进行mRNA测定。用Western blot检测TLR3蛋白和核内活性NF-κBp65蛋白的表达变化,用ELISA方法检测细胞培养上清中TNF-α蛋白变化。4. MT干预的体内实验MT分5mg·kg^-1、10 mg·kg^-1、20 mg·kg^-1三个剂量组,预先灌胃给药,连续七天。分别收集上述不同感染时间点的小鼠血清和肺,用半定量RT-PCR检测肺TLR3、MyD88、TNF-α和iNOS mRNA的表达变化,并对MT膜受体MT1、MT2以及核受体RORα进行mRNA测定。用Western blot检测TLR3蛋白和核内活性NF-κBp65蛋白的表达变化,用ELISA方法检测小鼠血清中TNF-α表达变化。结果:1. TLR3介导RSV感染所致炎症免疫反应的体外实验结果RSV感染4 h后即上调RAW264.7细胞TLR3、TNF-α和iNOS mRNA的转录水平;RSV感染8h后即可诱导活化TLR3蛋白和核内活性NF-κB蛋白的表达,并升高细胞培养上清中TNF-α的分泌量。各指标的变化与对照组相比差异均有显著性,并且随着RSV感染时间的延长而表达量增加。但MyD88 mRNA表达未见明显变化。2. TLR3介导RSV感染所致炎症免疫反应的体内实验结果RSV感染小鼠4 h后即能上调肺TLR3 mRNA的转录水平,诱导活化核内NF-κB蛋白的表达;RSV感染48 h后上调TNF-αmRNA的转录水平;感染72 h上调iNOS mRNA的转录水平。并于RSV感染48 h后观察到小鼠血清中TNF-α的分泌量也增加。各指标的变化较对照组差异均有显著性。但在感染24 h内未检测到肺组织中TLR3蛋白的表达;而MyD88 mRNA表达也未见明显变化。3. MT干预的体外实验结果MT三个浓度组（10-7M、10-6M、10-5M）在RSV感染RAW264.7细胞后4 h,即可下调RSV诱导的TNF-αmRNA的转录水平,其下调作用随着MT浓度的增加更加明显。而对于iNOS mRNA,10-7M的MT未能起到下调作用,10-6M和10-5M的MT则从RSV感染4 h开始就能下调iNOS表达,10-5M的作用更明显。结果还显示:MT在10-7M浓度时未能起到下调NF-κB的作用,10-6M和10-5M浓度MT则从RSV感染4 h开始就能下调其表达,10-5M的MT作用更明显。但各浓度组的MT对TLR3mRNA和蛋白的表达均没有明显的下调作用,而对MyD88 mRNA表达也未见明显影响。对MT受体的检测结果显示,RAW细胞均未检测到膜受体MT1、MT2的表达,而核受体RORα在各组均有表达且均匀一致。MT在10-7M浓度时未能起到下调细胞培养上清TNF-α蛋白的作用,10-6M和10-5M浓度MT则从RSV感染8 h开始就能下调其表达,其中10-5M的MT作用更明显。4. MT干预的体内实验结果MT在10 mg·kg^-1和20 mg·kg^-1剂量组时,均能在RSV感染72 h后下调RSV诱导的肺组织TNF-α和iNOS mRNA的转录水平。20 mg·kg^-1剂量的MT组在RSV感染4 h而10 mg·kg^-1剂量MT在RSV感染8 h,即可下调NF-κB的活性表达。MT在10 mg·kg^-1剂量时,从RSV感染的48 h开始可降低血清中TNF-α的产生,其中20 mg·kg^-1剂量的下调作用更明显。但各剂量组的MT对TLR3、MyD88和RORα的表达均不影响。我们也未检测到MT1、MT2的表达。结论:1. RSV感染可上调TLR3、TNF-α和iNOS mRNA的表达,诱导活化TLR3蛋白和核内NF-κB的表达,升高细胞培养上清和小鼠血清中TNF-α的分泌量。表明病毒诱导的炎症免疫反应与TLR3活化的信号转导途径有关,TLR3可能参与了RSV诱导的炎症免疫反应,推测是通过MyD88非依赖或部分依赖途径而活化NF-κB。2. MT在一定浓度和剂量范围内,能降低RSV诱导的RAW264.7细胞和肺的核内活性NF-κB的表达,下调RSV诱导的TNF-α和iNOS mRNA的转录水平,降低细胞培养上清和小鼠血清中TNF-α的分泌量。但MT对TLR3 mRNA和蛋白,MyD88和RORα的mRNA表达均无明显影响。3. MT抑制RSV诱导的NF-кB活化、下调TNF-α和iNOS的表达随着药物剂量（或浓度）的增加及感染时间的延长而更加明显。4. MT可能通过与其核受体结合,抑制NF-кB活化,发挥抗RSV感染所致的炎症反应。5.在RSV感染所致炎症免疫反应中,MT可能对TLR3、MyD88等上游信号分子无抑制作用。