目的:子宫内膜癌是女性生殖系统常见的三大恶性肿瘤之一,占女性生殖道恶性肿瘤的20%-30%。世界范围内,子宫内膜癌的发病率呈逐渐上升趋势。在美国,子宫内膜癌的发病率由2013年的49,560人上升至2018年的63,230人。手术是治疗早期内膜癌的主要手段,并且预后较好。但是对于处于晚期,复发或是存在转移病变的患者,治疗手段则有限,而且生存期在过去的几十年中亦没有提高。同时,最新研究已经认识到由于患者不同的患病风险因素,不同的生理病理学,不同的组织病理学和基因组特性,针对其中不同的分子信号通路进行靶向治疗是十分重要的。这些药物抑制重要信号通路上的重要位点,从而抑制子宫内膜癌的发生发展。因此,发现新的靶向药物或是联合传统的化疗药物是今后治疗晚期子宫内膜癌的一个重要方向。鞣花酸是一种多酚类化合物,是没食子酸的二聚衍生物,广泛存在于各类坚果,草莓,蓝莓,石榴中,且含量极高。目前许多研究结果显示鞣花酸表现出对化学物质诱导癌变及其他多种恶性肿瘤有较强调节作用,例如肺癌,膀胱癌,肝癌和卵巢癌。但鞣花酸在子宫内膜癌患者中的作用尚不明确。本研究通过多种生物信息学方法预测鞣花酸作用的信号通路,研究发现鞣花酸通过调节PI3K信号通路抑制子宫内膜癌细胞功能的作用。本研究结果为鞣花酸抗子宫内膜癌作用机制提供了新的思路,同时为研究鞣花酸的作用靶点提供新的研究方向。材料与方法:1、Drugbank,STRING数据库分析相关基因及构建互做网络将鞣花酸（Ellagic Acid）输入到Drugbank数据库中（www.drugbank.ca/）,查询其可能作用的靶蛋白或基因。将上述靶蛋白或基因输入到STRING数据库（https://string-db.org）中,选择“人类”种属,并将预测精度设定为0.9,以其提高预测准确性。将靶蛋白或基因以及预测的相互作用的上下游基因全部导出,进行下一步数据分析。2、Web Gestalt,c Bio Portal数据库进一步分析Hub基因将筛选出来的相互作用的基因全部输入到Web Gestalt数据库（http://www.webgestalt.org/）,通过与KEEG pathway数据比对,查找上述基因富集的信号通路。选取与肿瘤相关的信号通路,并将相关基因取交集,最后筛选出Hub基因。在c Bio Portal数据库中,输入已筛选的Hub基因,查阅其突变比率。3、细胞获取及培养子宫内膜癌细胞系KLE和AN3CA来源于中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。两种细胞培养于37℃,5%CO2及饱和湿度的培养箱。4、鞣花酸对子宫内膜癌细胞半抑制浓度的确定将子宫内膜癌细胞系KLE和AN3CA置入含有不同浓度梯度的鞣花酸培养液中48小时,酶标仪检查450nm波长的值。采用Graph Pad Prism 5.0描绘IC50曲线,同时根据曲线求得IC50对应的浓度值。5、细胞增殖实验Cell Counting Kit-8（CCK-8）试剂用于细胞增殖实验的测量,将KLE和AN3CA分别在96孔培养皿里培养,待细胞稳定生长后,逐孔加入0μM和20μM浓度的鞣花酸,按照0小时、24小时、48小时、72小时,再加入相应试剂,酶标仪测定450nm波长处的光度值。根据结果并利用前述软件描述增殖曲线,每组至少进行3次重复实验。6、细胞周期及细胞凋亡检测实验细胞周期试剂盒进行细胞周期的鉴定（南京凯基生物）。消化对照组和实验组的KLE和AN3CA细胞,收集细胞悬液,70%的预冷乙醇固定细胞,接着使用相应试剂进行染色,4℃避光反应,最后流式细胞仪测量相关数据。Annexin V-APC细胞凋亡试剂盒（南京凯基生物）用于测量对照组和实验组的KLE和AN3CA细胞的凋亡情况。消化对照组和实验组的KLE和AN3CA细胞,收集细胞悬液,Binding Buffer溶液固定细胞,接着混合Annexin V-APC及PI染料染色,最后流式细胞仪测量相关数据。7、迁移和侵袭实验根据鞣花酸对子宫内膜癌细胞的IC50值,设定0μM和20μM两种不同浓度鞣花酸作用于KLE和AN3CA,Transwell实验测定细胞迁移能力的改变。Transwell装置中铺上Matrigel胶,用于测定内膜癌细胞的侵袭情况。两种实验至少进行3次重复。8、RNA提取、反转录及实时定量PCR对照组与实验组的KLE和AN3CA子宫内膜癌细胞,用TRIzol试剂充分混匀,裂解出全部细胞中的RNA。接着测定RNA浓度和纯度,A260/280值维持在1.9-2.0之间,则提示RNA纯度较高。Takara反转录试剂盒对提取的RNA进行反转录,Light Cycler?480 II Real-time PCR实时定量PCR仪进行反转录反应。采用2-ΔΔCT法分析数据结果。9、Western blotting检查蛋白表达蛋白提取试剂盒（凯基生物）提取鞣花酸作用后子宫内膜癌细胞的全部蛋白。利用BCA蛋白浓度测定法测定蛋白浓度,将所测样品配平,然后进行跑胶电泳。检测PI3K,p-PI3K和MMP9蛋白的表达量变化情况。10、裸鼠体内转移成瘤实验将5周龄的雌性BALB/c裸鼠随机分成4组,其中两组为对照组,另外两组为KLE和AN3CA子宫内膜癌细胞构建的裸鼠体内肺转移模型。利用鼠尾静脉注射2×106子宫内膜癌细胞,在注射后2周,对实验组小鼠,按照体重经腹腔予以注射鞣花酸溶液,频率为1次/天,6天/周,持续注射3周。对照组予以生理盐水注射。到达预定治疗时间,行PET-CT检测,测定小鼠肺部转移瘤SUV摄取值。解剖裸鼠肺部,做石蜡病理切片及HE染色,显微镜测定转移灶数量。结果:1、鞣花酸可能对PI3K信号通路起调节作用通过Drugbank,STRING数据库分析构建鞣花酸作用网络,通过Web Gestalt,c Bio Portal数据库进一步分析Hub基因可能为EGFR,AKT1,PIK3CA,PIK3CB,PIK3CD,PIK3CG,PIK3R1,PRKCA和MAP2K1。其中,PIK3CA和PIK3R1两个基因突变频率较高,分别为41%和24%,同时它们负责编码PI3K的活性亚基。因此,鞣花酸可能对PI3K信号通路起调节作用。2、鞣花酸能够抑制子宫内膜癌细胞增殖、抑制细胞周期及促进细胞凋亡细胞增殖实验显示鞣花酸可以抑制子宫内膜癌细胞增殖和细胞周期,细胞周期被阻滞于G1期;同时,鞣花酸促进子宫内膜癌细胞的早期和晚期凋亡。根据实验结果,鞣花酸是通过抑制细胞周期和促进细胞凋亡,从而抑制细胞增殖。3、鞣花酸能够抑制子宫内膜癌细胞的迁移和侵袭迁移和侵袭实验表明,鞣花酸对子宫内膜癌细胞的迁移和侵袭能力有明确的抑制作用。进一步检测其分子机制,鞣花酸可以抑制PIK3CA和PIK3R1两个基因在m RNA的表达水平。在蛋白水平,鞣花酸可以抑制p-PI3K的表达量,进而抑制MMP9的表达量。4、体内实验检测鞣花酸抑制子宫内膜癌细胞的转移能力小鼠体内实验结果提示,用鞣花酸治疗后,小鼠肺部的转移瘤的SUV值摄取明显减少。裸鼠肺部被转移病灶行HE染色,结果提示应用鞣花酸治疗的裸鼠肺部转移灶数量明显减少。这些结果提示鞣花酸在体内可抑制子宫内膜癌细胞肺转移能力。结论:1、鞣花酸能够抑制子宫内膜癌细胞的生长,抑制细胞周期,促进凋亡,抑制迁移侵袭能力。2、鞣花酸可能通过调节PI3K信号通路抑制子宫内膜癌细胞功能。3、鞣花酸可抑制子宫内膜癌细胞在裸鼠体内形成转移瘤。