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本实验室分离到一株抗马铃薯甲虫、猿叶虫、柳兰叶甲等鞘翅目昆虫的苏云金芽孢杆菌菌株YM-03(Bacillus thuringiensis subsp.Morrisoni),采用特异性引物的PCR技术从菌株YM-03中克隆到杀虫晶体蛋白质基因cry3Aα基因。该基因序列已在GenBank中登记(No. AY572010),并被国际苏云金芽孢杆菌杀虫晶体基因命名委员会命名为cry3Aα8。该基因含有1,956 bp的读码框(ORF),编码652个氨基酸,序列比对分析表明,cry3Aα8与cry3Aα7有99%的同源性。将cry3Aα8和cryP1Ac/3Aα8(基因的启动子更换为高效抗鳞翅目害虫Bt菌株C-33的cry1Ac启动子)分别插入到穿梭载体pHT304,获得两个重组质粒pHT304/3Aα8和pHT304/P1Ac3Aα8,两个重组质粒分别转入苏云金芽孢杆菌无晶体突变株BMB171中,得到两个工程菌BMB171/3Aα8和BMB171/P1Ac3Aα8。
用SDS-PAGE、Western bolt和Bradford蛋白浓度测定的方法比较了cry3Aα8基因在工程菌BMB171/3Aα8、BMB171/P1Ac3Aα8和野生菌株YM-03中的表达,结果表明,目的基因在两个工程菌中均有表达,但在BMB171/3Aα8(12.2μg/ml)的表达量高于野生菌株YM-03(5.3μg/ml)和BMB171/P1Ac3Aα8(2.5μg/ml)的表达量;在BMB171/P1Ac3Aα8中的表达量最低,说明cry1Ac的启动子不适合cry3Aα8基因的表达。
此外还构建了在植物中表达的重组质粒pCAMBIA2301/3A,电转化农杆菌EHA105,得到含有重组质粒的农杆菌EHA2301/3A。对利用农杆菌介导的Bt杀虫基因在柑橘愈伤组织和上胚轴的转化进行了初步的研究。