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自然杀伤细胞(natural killer cells,NK)是天然免疫系统中重要的效应淋巴细胞,在肿瘤免疫监视方面发挥关键作用。NK细胞快速杀伤靶细胞无需预先免疫,也没有MHC限制性,NK细胞的活性依赖其表面组成性表达的抑制性和活化性受体信号的平衡。自然杀伤性受体(natural cytotoxicity receptors,NCRs)是NK细胞重要的活化性受体,其成员之一NKp30表达在所有人NK细胞表面,在NK细胞对抗病毒感染细胞和肿瘤细胞中扮演重要角色。Galectin-3(简称Gal-3)是p半乳糖苷结合蛋白家族成员之一,其包含两个碳水化合物结合区域,有较强的p半乳糖亲合力,能够被多种形式的肿瘤细胞表达。据报道,它可以直接作为免疫调节剂去诱导活化的T细胞的凋亡。尽管如此,它对NK细胞的影响还是不十分清楚,为此,构建和筛选了高效表达人NKp30胞外段和人IgGFc段嵌合蛋白的CHO细胞株,并由此获得有生物活性的可溶性NKp30-Fc蛋白。进一步使用人宫颈癌细胞系,以及宫颈腺癌异种移植的非肥胖性糖尿病和重症联合免疫缺陷(NOD-SCID)小鼠模型对Gal-3分子在NKp30介导的NK细胞抗肿瘤效应中的作用进行研究。主要取得了以下结果：1,重组人NK细胞活化性受体NKp30融合蛋白的制备和功能鉴定。我们构建了NKp30受体胞外段融合了人IgGl的Fc段(NKp30-Fc)的表达载体,利用脂质体转染中国仓鼠卵巢细胞(CHO-K1)的方法进行真核表达,通过G418抗生素加压筛选成功获得表达NKp30-Fc蛋白的细胞克隆,进一步通过有限稀释法获得高表达NKp30-Fc蛋白的细胞亚克隆。接下来我们采用ELISA方法筛选高分泌可溶性NKp30-Fc蛋白的亚克隆细胞,并收集其细胞无血清培养上清,使用亲和层析法进行可溶性NKp30-Fc蛋白的纯化.通过Western blotting方法进行纯化后鉴定,最终,我们获得的NKp30-Fc蛋白的纯度在90%以上。功能方面,我们通过流式细胞术发现可溶性NKp30-Fc蛋白能够结合NKp30配体阳性的肿瘤细胞,此外,51Cr同位素释放实验也证明了NKp30-Fc蛋白作为拮抗剂能够削弱NKp30介导的人NK细胞抗肿瘤效应。2,肿瘤细胞分泌的Gal-3作为人NKp30的可溶性抑制配体,在肿瘤逃逸NK细胞攻击中起重要作用。我们使用重组的人NK细胞活化性受体NKp30融合蛋白(NKp30-Fc)和人宫颈癌模型,发现可溶性NKp30-Fc能够免疫沉淀肿瘤细胞来源的Gal-3蛋白,NKp30和Gal-3的相互作用通过表面等离子体共振(surface plasmon resonance简称SPR)实验被进一步证明。我们的研究发现Gal-3以一种可溶形式被肿瘤细胞分泌,流式细胞术证明了可溶的Gal-3能够特异的结合NK细胞,进一步生物化学方法也证明了可溶的Gal-3能够结合NK细胞表面的NKp30分子。功能方面,当Gal-3被加入到NK-92与Hela细胞的共孵育系统时,我们发现NKp30介导的,而非NKG2D介导的,NK细胞表达CD107a能力和其细胞毒活性被抑制。若将可溶的Gal-3和NKp30-Fc蛋白预先孵育,这个抑制效应则被恢复。此外,51Cr同位素释放实验显示,若Gal-3表达被下调(shGal-3),将增强Hela细胞对NK细胞杀伤的敏感性,相反,Gal-3过表达(exGal-3)的Hela细胞对于NK细胞的杀伤将变得不敏感。这些体外的实验结果在shGal-3-HeLa或exGal-3-HeLa异种移植的,NK细胞过继免疫治疗后(?)NOD-SCID鼠模型中被进一步证明,表明了体内Gal-3能够强烈对抗人NK细胞抗肿瘤效应。终上所述：通过这里描述的方法制备的重组NKp30-Fc分子有足够的能力结合NKp30配体阳性的肿瘤细胞,能够与NKp30受体的天然,膜结合形式竞争。这个工具分子在定义NKp30与其配体的相互作用中具有广泛应用,同时有助于寻找NKp30受体功能的拮抗剂。此外,我们证明了肿瘤细胞分泌的Gal-3作为NK细胞活化性受体NKp30的可溶抑制性配体,能够抑制NK细胞抗肿瘤效应。此项研究提出了Gal-3能够调节NK细胞抗肿瘤免疫的新机制,或许能为肿瘤治疗提供新的治疗靶点。