第一部分香烟烟雾提取物对口腔黏膜上皮细胞活性和自噬标志物水平的影响【目的】口腔黏膜上皮细胞可抵御多种有害物质的侵袭,是口腔黏膜的“哨兵”。然而当有害物质的侵袭力大于宿主的清除能力时,口腔黏膜上皮细胞遭受破坏,进而降低口腔黏膜局部防御能力。吸烟是口腔黏膜常见的外界刺激,可通过多种方式损伤口腔黏膜上皮细胞从而破坏口腔黏膜上皮的完整性。本部分实验的目的是通过观察CSE、自噬抑制剂CQ及自噬诱导剂RAPA处理后的口腔黏膜上皮细胞系Leuk-1细胞的活性及自噬小体标志物LC3-II蛋白的表达情况,筛选出CSE的最佳作用浓度和作用时间,自噬抑制剂CQ及自噬诱导剂RAPA的最佳作用浓度,以进行后续实验。【方法】体外培养Leuk-1细胞,通过CCK-8法检测不同浓度的CSE(0、8%、16%、32%、64%),CQ(0μM、10μM、25μM、50μM、75μM、100μM)和RAPA(0μM、0.01μM、0.1μM、1μM、10μM)作用不同时间(3h、6h、12h、18h、24h、36h、2d、3d、5d)对口腔黏膜上皮细胞系Leuk-1细胞增殖能力的影响。使用免疫印迹(Western blot)技术进一步检测上述不同浓度、不同时间的CSE作用于Leuk-1细胞后,自噬小体标志物LC3-II的表达水平,评估其是否具有浓度和时间依赖性,从而进一步确定CSE的最佳作用时间及作用浓度。使用Western blot技术检测上述不同浓度的CQ和RAPA作用于Leuk-1细胞后,LC3-II的表达水平,评估其是否具有浓度依赖性,从而进一步确定CQ和RAPA的最佳作用浓度。【结果】CCK-8实验检测结果显示,4%、8%CSE处理Leuk-1细胞,细胞活力随着时间未见明显变化;本实验中所用不同浓度的CQ处理Leuk-1细胞,细胞活力随着实验不同作用时间后未见明显变化;用0.01μM、0.1μM和1μM浓度的RAPA处理Leuk-1细胞,细胞活力随着时间未见明显变化,但RAPA的浓度达到10μM,刺激24h后,细胞生长则被明显的抑制(P<0.05)。不同浓度的CSE、CQ、RAPA作用于Leuk-1细胞24h,Western blot结果显示:随着CSE浓度的升高,Leuk-1细胞中LC3-II的表达明显上升(P<0.05);随着CQ浓度的升高,Leuk-1细胞中LC3-II的表达明显上升(P<0.05),并在50μM浓度下呈最高趋势,100μM浓度的CQ未显著增加Leuk-1细胞中LC3-II的表达水平;同时,随着RAPA浓度的升高,Leuk-1细胞中LC3-II的表达明显上升(P<0.05),且在1μM浓度时达到最高水平。选用4%CSE作用于Leuk-1细胞不同时间后,Western blot结果显示:Leuk-1细胞中LC3-II的表达明显升高(P<0.05),且在24h达到最高峰。【结论】CSE对口腔黏膜上皮细胞中LC3-II的表达具有浓度和时间依赖性。且CQ、RAPA对口腔黏膜上皮细胞中LC3-II的表达具有浓度依赖性。根据本研究团队前期研究成果及本部分实验结果,在后续实验中选用4%浓度的CSE、50μM浓度的CQ和1μM浓度的RAPA作用于Leuk-1细胞24h后,检测口腔黏膜上皮细胞的自噬及凋亡水平以研究吸烟对口腔黏膜上皮细胞自噬及凋亡的影响。第二部分吸烟诱导口腔黏膜上皮细胞的自噬【目的】自噬是一个复杂的动态过程,主要包括形成和降解两个阶段。当自噬形成增加或降解受到抑制时,自噬小体数量均会增加。单独检测LC3-II表达水平的变化尚不能表明CSE可诱导Leuk-1细胞自噬。Beclin-1是自噬小体形成过程中的重要分子,当Beclin-1蛋白生成增多时,自噬小体形成增多,自噬活性增强,反之则自噬受到抑制;Sequestosome 1(SQSTM1/p62,简称p62)是一种自噬降解底物,自噬降解通路通畅时,p62水平下降;而降解通路受到抑制时,p62聚集增多;CQ抑制了自噬小体与溶酶体的融合以抑制自噬的发生,表现为自噬小体相对增多。本部分研究通过联合观察吸烟对Leuk-1细胞及小鼠颊黏膜上皮细胞LC3-II、Beclin-1以及p62表达的影响,以探讨吸烟对口腔黏膜上皮细胞自噬的影响。【方法】本部分实验分为细胞实验和动物实验两大部分。(1)细胞实验部分:使用CQ预处理细胞,然后再用4%CSE处理细胞,培养24h。提取细胞总蛋白,采用Western blot技术检测LC3-II、Beclin-1以及p62三者的表达水平。为了提供细胞自噬的进一步证据,我们分别进行了免疫荧光(IHC)实验观察LC3、p62的表达情况;透射电镜(TEM)实验以更加直观的观察自噬小体的形成情况。(2)动物实验部分:建立小鼠吸烟模型,小鼠随机分为两组,A组为暴露于空气的阴性对照组(n=6),B组为吸烟组(n=6)。提取小鼠颊黏膜组织总蛋白,采用Western blot技术检测小鼠颊黏膜上皮中LC3、Beclin-1以及p62三者的相应表达,免疫组化技术检测小鼠颊黏膜上皮中LC3、p62的表达情况。【结果】本研究发现单独使用CQ处理Leuk-1细胞后,LC3-II表达升高(P<0.05),Beclin-1和p62表达未见明显变化,提示CQ抑制了自噬小体与溶酶体的融合。单独使用4%CSE处理Leuk-1细胞后,p62表达显著下降(P<0.05),而Beclin-1以及LC3-II的表达则呈现升高趋势(P<0.05),提示细胞自噬的发生。与单纯CSE处理组相比,CQ+CSE联合处理组中LC3-II和p62的表达明显升高(P<0.05),而Beclin-1的表达未见明显升高(P<0.05)。免疫荧光结果显示4%CSE和CQ处理的Leuk-1细胞中LC3和p62明显升高(P<0.05)。透射电镜观察到,4%CSE处理组较空白对照组中自噬小体数量显著增加。动物实验Western blot结果显示,吸烟组小鼠中LC3-II和Beclin-1的表达明显升高(P<0.05),而p62的表达明显下降(P<0.05)。小鼠颊黏膜上皮免疫组化结果显示,吸烟组小鼠口腔黏膜上皮细胞中LC3表达升高(P<0.05),而p62则显著减少(P<0.05)。由此可见,细胞实验与动物实验两者结果呈现一致表现。【结论】体内和体外实验均表明,吸烟可以诱导口腔黏膜上皮细胞自噬的发生。第三部分自噬对吸烟引起的口腔黏膜上皮细胞凋亡的调控作用【目的】细胞凋亡是由多种基因严格控制的细胞自主且有序的死亡方式,在维持内环境的稳态中发挥了重要作用,凋亡过程的紊乱与许多疾病的发生发展密切相关。Caspase蛋白家族是细胞凋亡过程中最关键的蛋白之一,Caspase-3蛋白(Caspase蛋白酶家族中的一种关键蛋白酶)水平的变化可以间接反映细胞凋亡水平的高低。本实验通过检测香烟处理后的口腔黏膜上皮细胞与动物颊黏膜上皮细胞中凋亡相关蛋白Caspase-3的表达水平,以探讨吸烟对口腔黏膜上皮细胞凋亡的影响。自噬对细胞凋亡的调控作用越来越被学界关注,为探讨自噬在CSE诱导的口腔黏膜上皮细胞凋亡中发挥的作用,本实验分别采用CSE联合自噬抑制剂CQ与自噬诱导剂RAPA处理口腔黏膜上皮细胞,通过Western blot技术检测凋亡相关蛋白的表达水平;采用Annexin V-FITC/PI双染色流式细胞术检测细胞凋亡率,以观察自噬在CSE引起的口腔黏膜上皮细胞凋亡中的调控作用。【方法】细胞实验与动物实验中均采用Western blot技术观察凋亡相关蛋白Caspase-3的表达水平,以探讨吸烟对口腔黏膜上皮细胞凋亡的影响。为探讨自噬在CSE诱导的口腔黏膜上皮细胞凋亡中发挥的作用,采用以下方法进行检测和验证。利用Annexin V-FITC/PI双染色流式细胞术检测分析不同处理组(Control,4%CSE,50μM CQ,50μM CQ+4%CSE)的口腔黏膜上皮细胞凋亡率,以探讨自噬抑制剂CQ对CSE诱导的口腔黏膜上皮细胞凋亡的影响。其次,使用自噬诱导剂RAPA预处理Leuk-1细胞以激活自噬活性。利用AnnexinV-FITC/PI双染色流式细胞术进行不同处理组(Control,4%CSE,1μM RAPA,1μM RAPA+4%CSE)细胞凋亡率的检测分析,以探讨自噬诱导剂对CSE诱导的口腔黏膜上皮细胞凋亡的影响。【结果】细胞实验与动物实验均发现吸烟使口腔黏膜上皮中活化的Caspase-3(Ccasp3)的表达水平升高。Western blot结果显示,CQ预处理使CSE诱导的Leuk-1细胞中C-casp3表达水平进一步提高,RAPA预处理使CSE诱导的Leuk-1细胞中C-casp3的上升幅度下降(P<0.05)。流式细胞术检测结果表现为CQ预处理细胞组较单纯CSE处理组细胞凋亡率增高(P<0.05);与之相反,使用RAPA预处理细胞组相较于单独使用CSE处理组的细胞凋亡率降低(P<0.05)。【结论】吸烟可诱导口腔黏膜上皮细胞凋亡;在抑制自噬的情况下,CSE诱导的口腔黏膜上皮细胞的凋亡水平进一步升高;在激活自噬的情况下,CSE诱导的口腔黏膜上皮细胞的凋亡水平受到一定程度抑制,提示自噬在CSE诱导的口腔黏膜上皮细胞凋亡中发挥了抑制作用。