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第一部分小鼠KLF14基因真核过表达质粒的构建及鉴定目的：构建及鉴定小鼠pIRES2-EGFP-KLF14真核过表达载体。方法：首先从小鼠组织提取总RNA，通过RT-PCR的方法获取目的DNA，再经胶回收、纯化、双酶切以及与过表达载体pIRES2-EGFP连接，构建重组质粒pIRES2-EGFP-KLF14，最后利用双酶切以及DNA测序对重组质粒进行鉴定。结果：重组质粒的酶切产物经琼脂糖凝胶电泳后，成像显示两条带，大片段约5.3Kb（pIRES2-EGFP线性化质粒）和小片段约1000bp（KLF14的PCR产物），初步鉴定重组质粒构建成功。DNA测序结果经BLAST进行序列分析，结果显示其核酸序列与GenBank中小鼠KLF14基因的CDS区序列完全一致，进一步证明重组质粒构建成功。结论：成功构建了小鼠pIRES2-EGFP-KLF14真核过表达质粒，为后续细胞实验研究KLF14过表达对糖代谢以及胰岛素抵抗的影响提供技术手段和奠定坚实基础。第二部分KLF14基因mRNA在小鼠各组织的分布情况分析目的：观察转录水平上KLF14基因在健康C57BL/6J小鼠体内各组织的表达分布情况。方法：将小鼠颈椎脱臼处死后，首先取其多处组织如心脏、肝脏、肾脏、脑、脾脏、肺、胃、肠、附睾、骨骼肌、脂肪，并提取各组织RNA，经逆转录获取cDNA；然后通过实时荧光定量PCR（real-timePCR）的方法，检测KLF14基因mRNA在各组织的表达分布情况，实验重复三次。结果：转录水平上KLF14基因在小鼠体内普遍表达，其mRNA相对表达量由高到低依次为心脏、骨骼肌、肝脏、脂肪、小肠、肾脏、脑、肺、胃、脾、附睾。结论：KLF14基因在小鼠体内普遍表达，其中心脏、骨骼肌、肝脏等组织的相对表达量较高，为探讨KLF14在糖代谢中的调控作用，我们选择肝细胞作为体外研究对象，以进一步研究KLF14的生理功能。第三部分KLF14基因过表达对相关信号通路中关键信号分子的影响研究目的：观察KLF14过表达对InsR/IRS/AKT/GSK-3β以及AMPK/TORC2/PEPCK信号通路中关键信号分的影响，探讨KLF14影响糖代谢以及胰岛素抵抗的分子生物学机制。方法：建立KLF14过表达的体外研究肝癌细胞模型，分组（空白对照组、INS处理组、KLF14转染组和INS+KLF14处理组）并分别加以处理，然后采用western blot的方法，检测KLF14对两条信号通路中关键信号分子的影响。采用[3H]-2-脱氧-D-葡萄糖摄取法检测肝癌细胞对葡萄糖的摄取率。结果：INS处理hepa1-6小鼠肝癌细胞后，KLF14转染组与未转染组相比，除p-InsR表达无明显改变外，其他指标如p-IRS、p-AKT、p-AMPK、p-TORC2表达均明显增加，差异具有统计学意义（P<0.01）；另外，糖原合成关键酶p-GSK3β表达亦明显增加，而糖异生关键酶PEPCK的表达量明显降低，差异均具有统计学意义（P<0.01）；葡萄糖摄取率也较转染前明显升高（P<0.01）。结论：KLF14过表达一方面可能通过活化胰岛素经典信号通路PI3K/AKT，从而改善肝细胞的胰岛素抵抗，另一方面可能通过抑制肝糖异生，并促进糖摄取和肝糖原的合成，从而改善糖代谢。