蜱是家畜体表的一种吸血性外寄生虫,作为传播媒介,可传播多种由病毒、细菌、螺旋体、立克次氏体及血原虫等疾病,不仅给畜牧业造成了严重的经济损失,同时还给人类公共卫生带来极大的危害。我国目前发现的蜱种有100多种,其中,亚洲璃眼蜱(Hyalomma asiaticum)是我国的主要优势蜱种,主要传播环形泰勒虫病、巴贝斯虫病和新疆出血热。当今世界,免疫预防被认为是最有潜力的防治策略,而获得相应的靶抗原是免疫预防的前提条件。组胺结合蛋白HBP(Histamine binding protein,HBP)是蜱体内为抑制宿主的免疫应答而合成并分泌的一种免疫调节蛋白,在蜱吸血的过程中它具有与宿主所释放的组胺结合的能力,从而识别自己宿主的免疫应答,以保证其持续长时间的吸血。蜱体内HBP的重要作用使之成为抗蜱及蜱传病的候选抗原分子之一。本课题以亚洲璃眼蜱为研究对象,通过从亚洲璃眼蜱体内克隆HBP基因,并在体外表达,分析其功能,为蜱及蜱传疾病的免疫预防做一些探索性工作。首先,以亚洲璃眼蜱唾液腺差异表达基因文库中的可表达序列标签(Express Sequence Tag,EST)序列为基础,设计基因特异性引物3’-GSP和3’-Nested-GSP用于目的基因3’端的扩增,PCR产物经纯化、克隆到pGEM-T easy载体、转化大肠杆菌DH5α并对其测序。根据测序结果和已知的EST序列,设计基因特异性引物5’-GSP1、5’-GSP2和5’-Nested-GSP用于目的基因5’端扩增,PCR产物经纯化、克隆到pGEM-T easy载体、转化大肠杆菌DH5α并对其测序。根据3’端、5’端测序结果和已知的EST序列,拼接出目的基因的全长并设计基因特异性引物F-Primer和R-Primer用于扩增全长基因,PCR产物经纯化、克隆到pGEM-T easy载体、转化大肠杆菌DH5α并对其测序,结果从亚洲璃眼蜱体内克隆出一个HBP基因的全长序列。基因全长为902bp,编码227个氨基酸,预测分子量为25.9kDa (包括信号肽),经Blast同源性分析比较,该基因预测氨基酸与已报道的其它硬蜱组胺结合蛋白高度同源,故命名为亚洲璃眼蜱组胺结合蛋白(Hyalomma asiaticum Histamine binding protein,HaHBP)。结构上,HaHBP具有组胺结合蛋白二级结构的典型特征,即含有β桶结构,这是组胺结合的部位,构成这种二级结构是由两个二硫键和仅有的四个或五个色氨酸残基(W)部分决定。HaHBP编码的氨基酸序列与已鉴定的组胺结合蛋白在相当或相近的位置均有相同或相近的半胱氨酸(C)与色氨酸残基(W),这与组胺结合蛋白的结构特点相吻合。综合同源性、结构特征、分子量、信号肽、基因表达特点等生物信息学分析结果,初步预测HaHBP为一个编码亚洲璃眼蜱组胺结合蛋白的一个基因。其次,利用RT-PCR方法对HaHBP基因在亚洲璃眼蜱体内分布情况进行分析,别提取亚洲璃眼蜱的各个发育阶段包括卵、幼蜱、若蜱、未吸血成蜱、半饱血成蜱和不同解剖部位包括壳、唾液腺和肠的总RNA,取相同量的总RNA进行RT-PCR分析,结果表明,该基因的表达具有性别特异性,在蜱的各个发育阶段仅吸血的雌蜱表达;且HaHBP基因在亚洲璃眼蜱半饱血雌蜱的唾液腺、壳及中肠这三个器官中均高效表达。再次,构建了重组表达质粒载体,并转化表达宿主菌BL21(DE3),经IPTG诱导,结果表明HaHBP可以在原核表达系统中高效表达,应用GST纯化系统,可获得较纯的目的蛋白,Western-blot结果表明原核表达的融合蛋白具有很好的免疫原性。最后,以纯化得到的融合蛋白GST-HaHBP(GST蛋白作阴性对照)作为抗原包被于ELISA酶标板4℃过夜,洗涤后,加入Histamine-HRP酶结合物37℃反应2h,充分洗涤后,加入K—Blue底物显色10min后,加入终止液5min,酶标仪测定OD值。首次证明了HaHBP具有结合组胺的活性。综上所述,本研究成功地克隆到亚洲璃眼蜱组胺结合蛋白基因;经原核表达的重组蛋白具有良好的免疫原性,为抗亚洲璃眼蜱疫苗的研制提供了新的候选抗原分子,对蜱及蜱传疾病的防治具有重要意义。