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茶轮斑病是危害茶树[Camellia sinensis(L.)O.Kuntze]生产的重要病害,严重时可导致叶片大量脱落,影响茶叶品质和产量,目前在我国茶园中广泛发生。茶拟盘多毛孢(Pestalotiopsis theae)是引起茶轮斑病的优势种。我们前期在田间分离获得了一株致病力丧失的茶拟盘多毛孢菌株LI-41,其较正常菌株表现出菌落形态异常,菌丝生长速度缓慢。本研究是针对菌株LI-41生物学性状发生变化的原因进行了探索,所得结果如下:对菌株LI-41和正常菌株(TP-2-2W)的菌丝进行双链RNA(double stranded RNA,ds RNA)的提取,发现LI-41菌株中含有4条ds RNA片段(ds RNA1-4),随机克隆以及末端克隆测序显示,其大小分别为3387、2831、2599和932 nt,分析推测每一条ds RNA分别编码一个独立的开放阅读框(Open-Reading Frame,ORF),依次命名为ORF1、ORF2、ORF3和ORF4。将获得的4条ds RNA序列编码蛋白采用BLASTp与登录在NCBI中的序列比对,显示该病毒ORF1-3编码蛋白与金色病毒属的胶孢炭疽菌金色病毒-1(Colletotrichum gloeosprioides chrysovirus 1,Cg CV-1)编码蛋白相似性最高,相似率分别为65%、48%和54%,而ORF4编码蛋白未搜到任何病毒的同源序列,我们将其命名为茶拟盘多毛孢金色病毒-1(Pestalotiopsis theae chrysovirus 1,Pt CV-1)。根据与已知蛋白的相似性推测,Pt CV-1的ORF1编码依赖RNA的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase,Rd Rp),ORF2编码外壳蛋白(Coat protein,CP),ORF3编码甲基转移酶,ORF4所编码的蛋白功能未知。采用蔗糖梯度超速离心法提纯Pt CV-1的病毒粒体,分别从蔗糖各梯度层的病毒粒子提取核酸,结果显示在20%-50%蔗糖层均存在4条核酸链,大小与从菌丝中提取的4条ds RNA大小一致,其中50%蔗糖层中病毒含量最高。将50%蔗糖层纯化的病毒粒子进行铜网吸附后负染,经透射电镜观察,观察到了球形病毒粒子,其直径为30.1~39.8 nm。将LI-41诱导产孢,挑选42个分生孢子培养后,进行Pt CV-1的ds RNA检测,结果显示67%分生孢子再生后代仍含有Pt CV-1。将LI-41与分生孢子再生无毒菌株(LI-41-1)对峙培养,在LI-41-1菌落边缘挑取50个菌丝块进行ds RNA检测,结果显示有6个传毒后代检测结果呈阳性,表明Pt CV-1可以水平传毒给遗传背景相同的菌株。用PEG介导病毒粒子和核酸转染单孢无毒后代菌株(LI-41-1)的原生质体,然后对转染原生质体的后代菌株进行培养,分别筛选150个原生质体再生后代菌株进行ds RNA检测,结果显示,仅有5个病毒粒子转染后代菌株检测到了Pt CV-1的ds RNA条带。由此推测,该病毒的核酸可能不具有侵染性,但可以通过病毒粒子和水平传毒的方式传染给无毒的分生孢子后代菌株中。比较分生孢子后代无毒菌株(LI-41-1、LI-41-2、LI-41-3)、原始带毒菌株(LI-41)、分生孢子后代带毒菌株(LI-41-V1、LI-41-V2)、病毒粒子传毒后代菌株(LI-41-1T1、LI-41-1T2、LI-41-1T3)和对峙培养传毒后代菌株(LI-41-1P-1、LI-41-1P-2、LI-41-1P-3)生物学性状表明,带毒菌株和无毒菌株菌落形态和致病力表现显著差异:带毒菌株较无毒菌株均色素增多,菌丝轮纹圈消失;菌落畸形;生长速度降低,正常菌株为6.5-6.7 mm/d,带毒菌株为2.0-2.8 mm/d;致病力减弱,在来源于云南和广西本地种茶叶上,无毒菌株接种引起的病斑大小分别为11.9-14.1 mm和17.5-21.5 mm,而带毒菌株没有引起明显的病斑。以上结果表明:Pt CV-1侵染茶拟盘多毛孢可引起其菌丝畸形,生长速度减弱和致病力显著降低。本研究报道了侵染茶拟盘多毛孢的金色病毒属新成员Pt CV-1,并明确该病毒可以引起茶拟盘多毛孢生长异常、生长速度和致病力减弱。据我们所知,这是国际上茶拟盘多毛孢内报道的首例真菌病毒。Pt CV-1能够显著改变寄主的致病力,可望进一步应用于茶拟盘多毛孢的生防研究;Pt CV-1的发现也是国际首例真菌病毒-茶拟盘多毛孢研究系统,为采用反向遗传学深入研究茶拟盘多毛孢基因功能奠定基础。