【研究背景】阿尔兹海默病（Alzheimer’s disease,AD）是一种进行性发展的神经退行性疾病,也是最主要的年龄相关性痴呆,其发病率随着全球的人口老龄化程度加重而逐年增加。AD最典型的临床表现为进行性认知功能损害和精神行为失常,其主要的病理特征为β-淀粉样蛋白（β-amyloid,Aβ）沉积形成老年斑（senile plaques,SPs）,tau蛋白异常磷酸化产生的神经元纤维缠结（neurofibrillary tangles,NTF）,神经元变性丢失引起的脑实质的萎缩。作为AD的重要病理改变之一,β-淀粉样蛋白（β-amyloid,Aβ）沉积和代谢往往与认知障碍和记忆损伤的严重程度正相关。近年许多研究发现,可溶性的Aβ肽段的寡聚体,尤其是Aβ1-42的寡聚体被认为是神经毒性作用最强的Aβ片段,可引起神经元与突触丢失,突触可塑性损伤,中枢神经系统慢性炎症反应。而已知的Aβ受体,可分为促进Aβ降解或从脑内转运清除的“好”受体,和结合Aβ促使其聚集形成斑块的“坏”受体,且同一种受体在AD发展的不同的阶段,或结合不同大小形态的Aβ片段,可能发挥截然不同的作用。小鼠脑内的成对免疫球蛋白样受体B（paired immunoglobulin-like receptor B,PirB）及人类同源的白细胞免疫球蛋白样受体B（leukocyte immunoglobulin-like receptor B,Lilr B）被发现可以作为Aβ1-42寡聚体的高亲和力受体,其主要参与Aβ1-42寡聚体的突触可塑性损伤作用。以往有研究证实,用人工合成的PirB蛋白的胞外段,竞争性抑制PirB的活性,可以挽救因缺血缺氧引起的神经功能和认知功能损伤。PirB作为Aβ受体,在Aβ的聚积和降解以及在AD病程发展中发挥的作用和机制尚不明确。细胞能量代谢紊乱,AMPK/mTOR信号通路异常和自噬功能受损等也都参与AD的发生和发展,而激活AMPK/mTOR通路,可以改善AD转基因模型和由多种诱因（高糖、缺血、缺氧等）引起的认知功能损伤和病理改变。【研究目的】1.探究PirB与脑内Aβ沉积的关系。2.探究PirB的水平对Aβ病理改变和认知功能的影响及其机制。【研究材料和方法】1.检测小鼠脑内PirB的表达及Aβ的水平。取9月龄APP/PS1转基因小鼠与同月龄野生型小鼠（每组6只）,不同月龄野生型C57BL/6小鼠（3月龄、9月龄、12月龄）（每组6只）,的海马组织,以及9月龄C57BL/6小鼠不同脑区组织,检测PirB的表达（免疫印迹、实时荧光定量逆转录PCR）、分布（免疫组化）、以及PirB在APP/PS1小鼠脑内与Aβ的位置关系和在神经元细胞的分布情况（免疫荧光）。2.过表达PirB,并检测细胞对Aβ1-42寡聚体的摄入及自噬功能和AMPK/mTOR信号通路。1)在稳定培养的HEK293细胞（DMEM basic+10%FBS）上通过质粒过表达PirB或载体,经过外源性的给与人工合成的携带FTIC荧光标签Aβ1-42寡聚体（1mM）处理2小时,荧光显微镜下观察过表达PirB对细胞对Aβ1-42寡聚体摄入量的变化。2)在稳定培养的HEK293细胞上通过质粒过表达PirB或载体,并外源性的给与人工合成的Aβ1-42寡聚体（1mM）或溶剂（含0.01%DMSO）处理2小时,将细胞分组为(Vector-DMSO、Vector-Aβ1-42、PirB-DMSO和PirB-Aβ1-42),用CCK-8试剂检测四组细胞的抑制指数;并检测四组细胞P62、LC3蛋白水平（免疫印迹）反映自噬功能。3)在稳定培养的HEK293细胞上将GFP-LC3-RFP质粒与过表达PirB或载体的质粒共转,并外源性的给与人工合成的Aβ1-42寡聚体（1mM）,荧光显微镜下观察,并统计自噬溶酶体和总自噬小体的比值（RFP-LC3/GFP-LC3+RFP-LC3）。4)在稳定培养的HEK293细胞上通过质粒过表达PirB或载体,并用Aβ1-42寡聚体处理2小时,检测AMPK/mTOR信号通路的活性(免疫印迹检测AMPK、p T172-AMPK、mTOR、pS2448-mTOR)。3.过表达PirB,并检测APP/PS1转基因小鼠的认知功能和Aβ病理改变。将18周的APP/PS1转基因小鼠（16只）随机分为两组,每组8只,分别在海马CA3区立体定位注射表达PirB和载体的腺相关病毒（AAV）（1μl）,表达PirB和载体（APP/PS1-PirB、APP/PS1-Vec）,并用同笼同龄被鉴定为野生型（WT）的C57BL/6小鼠作为对照（16只）,也分两组,每组8只,同样在海马CA3区注射AAV（1μl）,过表达PirB和载体（WT-PirB、WT-Vec）。表达一个月后检测小鼠认知和学习记忆功能（新物体识别试验、Morris水迷宫试验）,并取材,AAV表达情况在荧光显微镜下观察。检测四组小鼠海马内APP和Aβ量的改变（免疫印迹、ELISA）和脑片中Aβ斑块形成情况和Aβ斑块与PirB的位置关系（免疫荧光）。检测四组小鼠海马的P62、LC3（免疫印迹）反映自噬功能,以及AMPK/mTOR信号通路(免疫印迹检测AMPK、pT172-AMPK、mTOR、pS2448-mTOR)4.抑制PirB表达,检测细胞对Aβ1-42寡聚体的摄入及Aβ诱导的自噬功能和AMPK/mTOR信号通路。1)在稳定培养的N2a细胞（10%FBS+45%DMEM basic+45%Opti-MEM）上通过转染PirB-si-RNA质粒或载体质粒,再外源性地给与合成的Aβ1-42寡聚体（2mM）处理2小时作为摄入组(Vec+Aβ1-42-uptake、siPirB+Aβ1-42-uptake),和更换培养基继续培养6小时作为降解组(Vec+Aβ1-42-degrade、siPirB+Aβ1-42-degrade),并以添加Aβ1-42的溶剂组作为空白对照（Vec-blank、siPirB-blank）,检测6组N2a细胞裂解液中的Aβ1-42含量（ELISA）反映对Aβ1-42寡聚体的摄入与降解能力。2)在稳定培养的N2a/APP细胞（稳转人源性APP）上通过转染PirB-si-RNA质粒或载体质粒（N2a/APP-Vec、N2a/APP-siPirB）,检测两组细胞Aβ1-42的水平（ELISA）APP和sAPP的水平（免疫印迹）和P62、LC3水平（免疫印迹）反映自噬功能,以及AMPK/mTOR信号通路(免疫印迹检测AMPK、pT172-AMPK、mTOR、p S2448-mTOR)。5.抑制PirB表达,并检测APP/PS1小鼠的认知记忆功能。取10只8周的APP/PS1小鼠（刚出现Aβ沉积时）,随机分为两组,每组5只,分别在海马CA3区立体定位注射表达si-RNA-PirB和载体的腺相关病毒（AAV）（1μl）,APP/PS1-siPirB、APP/PS1-Vec,检测病程中期（28周）认知功能的改变（新物体识别试验、Morris水迷宫试验）。【研究结果】1.PirB的表达水平与Aβ的水平呈正相关。1)PirB的表达在野生型C57BL/6小鼠脑内随年龄增加而增加,且PirB在海马的表达略高于皮层,略低于小脑:2)与同月龄同笼野生型小鼠相比,PirB的表达在9月龄APP/PS1转基因小鼠海马内明显增加,其增加主要分布于海马CA3区和DG区;3)免疫荧光共染显示PirB蛋白与Aβ存在共定位,并且与同月龄同笼野生型小鼠相比,9月龄APP/PS1转基因小鼠的海马CA3区的锥体神经元的PirB水平增加。2.过表达PirB促进细胞对Aβ寡聚体（Aβo）的摄入,并加重Aβo对细胞自噬功能和AMPK/mTOR信号通路的抑制。1)过表达PirB使HEK293细胞摄入更多的Aβo;2)过表达PirB并外源添加Aβo使HEK293细胞裂解液的P62、LC3-Ⅰ水平增加,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值降低;3)GFP-LC3-RFP质粒与过表达PirB质粒共转,并外源添加Aβo,荧光显微镜下观察到,过表达PirB组的自噬溶酶体（RFP-LC3）与总自噬小体（RFP-LC3+GFP-LC3）比值降低;4)过表达PirB并外源添加Aβo使HEK293细胞裂解液的AMPK、pT172-AMPK水平降低,pS2448-mTOR水平增加,mTOR水平没有明显变化。3.过表达PirB加重APP/PS1小鼠的Aβ沉积和认知记忆功能损伤。1)过表达PirB使5月龄APP/PS1转基因小鼠出现学习认知功能障碍,但对野生型小鼠的认知记忆功能没有明显影响。新物体识别试验中,过表达PirB的APP/PS1小鼠对新物体的偏好指数降低,不影响总的探索时间;Morris水迷宫试验,定位航行试验中,过表达PirB的APP/PS1小鼠找到逃逸平台的潜伏期增加,空间探索试验中,过表达PirB的APP/PS1小鼠进入目标区域的潜伏期增加,穿越平台区域的次数减少。2)脑片免疫荧光（GFP/PirB）显示病毒表达良好,海马CA3区PirB表达增加。脑片过表达PirB使APP/PS1小鼠海马匀浆的APP、可溶性APP（sAPP）水平明显增加,Aβ1-40、Aβ1-42水平和Aβ1-42/Aβ1-40的比值增加;然而,过表达PirB使野生型小鼠海马匀浆的可溶性APP（sAPP）轻度降低,Aβ1-40水平不变,而Aβ1-42水平降低。3)过表达PirB使APP/PS1小鼠海马匀浆的P62、LC3水平增加,AMPK、p T172-AMPK水平降低,pS2448-mTOR、mTOR水平增加;而过表达PirB的野生型小鼠的P62、LC3水平没有明显改变,AMPK、pT172-AMPK水平却有所升高,且p S2448-mTOR的水平降低,mTOR水平没有明显改变。4)过表达PirB使APP/PS1小鼠海马出现突触蛋白的改变,突触前蛋白Synapsin1的水平降低而突触后蛋白PSD95的水平升高。4.抑制PirB表达使神经细胞对Aβ1-42寡聚体的摄入减少,且逆转了Aβ诱导的自噬功能和AMPK/mTOR的抑制作用。1)与表达载体或过表达PirB组相比,抑制PirB表达使N2a细胞对Aβ1-42寡聚体的摄入减少,而降解增多,胞内的Aβ1-42减少,8h后降解的Aβ1-42也更多;2)N2a/APP细胞上抑制PirB表达,胞内APP、sAPP的水平明显降低,且细胞裂解液中的Aβ1-42水平降低;3)抑制PirB表达使N2a/APP细胞裂解液中的P62水平降低,LC3-Ⅰ水平没有明显变化、但LC3-Ⅱ水平升高,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值降低;并且,AMPK、pT172-AMPK水平升高,pS2448-mTOR水平降低,mTOR水平没有明显变化。5.抑制PirB表达改善APP/PS1转基因小鼠的认知记忆功能。与同月龄注射载体病毒（AAV-VEC）的APP/PS1小鼠相比,抑制PirB表达组（AAV-siPirB）的APP/PS1小鼠认知功能得到改善,新物体识别试验中,AAV-siPirB的APP/PS1小鼠对新物体的偏好指数升高,且对物体的总的探索时间有轻微提高;Morris水迷宫试验,定位航行试验中,AAV-siPirB的APP/PS1小鼠找到逃逸平台的潜伏期减少,空间探索试验中,AAV-siPirB的APP/PS1小鼠进入目标区域的潜伏期减少,穿越平台区域的次数增加,在目标平台所在象限的停留时间也增加。【研究结论】1.PirB的表达与脑内Aβ的水平呈正相关,并在胞内与Aβ共定位。2.PirB促进Aβ沉积并加重Aβ诱导的认知功能障碍,其机制是通过抑AMPK/mTOR介导的细胞自噬功能。3.抑制PirB表达改善Aβ病理及其相关的认知功能障碍。因此,PirB可能是AD治疗的潜在靶点。