第一部分周围神经损伤后大鼠背根节神经元转录组分析目的寻找调控DRG突起生长的关键生物学过程以及信号通路,并探讨其作用机制。方法1.制备大鼠坐骨神经挤压伤模型;2.提取样品RNA,采用Illumina Hi Seq?进行转录组测序。对大鼠坐骨神经损伤0 h、3 h、9 h、1 d、4 d和7 d的L4-L6 DRG中m RNA的表达谱进行了系统性分析;3.筛选差异表达基因;4.运用生物信息分析软件对差异表达基因进行聚类、功能富集情况(GO)、KEGG pathway和基因网络分析;5.对测序结果进行q RT-PCR验证。结果1.系统性分析了L4-L6背根神经节神经元在损伤后5个不同时间点转录组的变化,一共找到1688个差异表达的基因;2.对差异表达基因聚类以及功能富集分析,发现与离子运输、细胞离子稳态、钙离子运输、调节神经元的投射发育、防御应答、调节细胞死亡、细菌感染应答、调节细胞激活等相关;3.差异表达基因网络分析发现基因之间的相互作用主要涉及神经系统、感觉系统、免疫系统、信号转导、信号分子间的相互作用以及细胞间通讯等;4.q RT-PCR证实众多关键基因的表达变化和测序结果一致。结论本研究通过RNA-Seq完成了大鼠坐骨神经挤压伤后背根节神经元转录组分析;结果表明,周围神经损伤后9h时的早期反应阶段,涉及转录因子、炎症因子、G蛋白受体、钙调节、凋亡;损伤后1d时再生启动阶段,涉及转录因子、细胞分化与生长、黏附分子、轴突延伸、生长因子等通路被激活;这些神经损伤后细胞生物学过程的分子调控模式的研究,为阐明周围神经损伤后再生的分子调控机制提供了新的内容。第二部分Vav1对神经再生的影响及其基因表达调控网络分析目的寻找调控DRG神经元突起生长的重要调控基因,揭示Vav1对神经再生的影响,并探讨其作用机制。方法1.结合测序验证情况和生物信息学分析选取部分基因在体外培养的背根神经节神经元中进行功能学研究;2.对测序结果进行q RT-PCR验证;3.Western blot检测损伤后DRG中Vav1的表达情况;4.免疫组化检测损伤后的DRG神经元中Vav1的表达情况;5.通过测量神经元突起长度分析在神经元中si RNA干扰Vav1对背根神经节神经元突起生长的影响;6.IPA分析Vav1相关基因调控的网络。结果1.q RT-PCR证实Vav1的表达变化和测序结果一致;2.Western blot结果显示损伤后DRG中Vav1的表达持续上调;3.免疫组化结果显示Vav1主要在损伤后的DRG神经元中表达;4.突起生长实验发现si RNA干扰Vav1的表达能抑制背根神经节神经元突起的生长;5.IPA分析发现Vav1相关基因调控的网络中众多分子参与了神经再生过程。结论1.Vav1基因在周围神经损伤后的表达逐步增强,4d时最为显著;2.免疫荧光细胞化学法显示,Vav1基因蛋白在DRG神经元中表达,其神经损伤后的表达逐步增加;3.体外si RNA干扰实验,显示si RNA干扰Vav1基因可明显抑制DRG神经元突起生长;4.神经损伤后,Vav1基因的表达调控在不同时期,分别与SLA、IL6、Jun、SH2B2、EZH2等重要基因相互作用。综合实验结果,Vav1基因很可能是神经损伤与再生过程中分子调控密切相关的重要功能基因。