脓毒症(sepsis)是机体对感染的反应失调而导致危及生命的器官功能障碍,是临床上常见的急危重症,全球年患病人数达数百万,病死率约25%。脓毒症常引起急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征(acute lung injury,ALI/acute respiratory distress syndrome,ARDS),ALI/ARDS是一种常见的急性缺氧性呼吸衰竭伴双侧肺弥漫性炎性损伤的综合征,以气体交换功能障碍、中性粒细胞大量浸润、血管通透性增加及肺实质损伤为病理特征,病死率持续居高不下。虽然治疗上取得了一定的进展,但脓毒症患者因ALI/ARDS死亡所占比重仍然很大,因此寻求新的治疗方法是临床亟待解决的问题。干细胞,尤其是脂肪来源的间充质干细胞(adipose-derived mesenchymal stem cells,ADMSCs)可以改善炎症和氧化应激反应,用于治疗与炎症、组织损伤等相关性疾病。既往动物研究发现间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)可以降低脓毒症的病死率,但这一结论仍存在争议。此外,3项小型临床I期试验证明了 MSCs治疗脓毒症患者的安全性。有关MSCs治疗脓毒症ALI/ARDS的研究较少,因此我们将从以下四部分进行探讨MSCs治疗脓毒症ALI/ARDS的具体作用机制,以期为MSCs治疗脓毒症提供基础理论依据和强有力的循证医学证据。第一部分:MSCs治疗脓毒症动物的Meta分析目的既往动物研究发现MSCs可降低脓毒症的病死率,但这一结论仍存在争议。本部分通过Meta分析系统评价了 MSCs治疗脓毒症动物的疗效。方法计算机检索 MEDLINE、EMBASE、Cochrane CENTRAL 以及 Web of Science 等数据库,检索时间从建库起至2019年11月17日。依据纳入和排除标准,筛选、评估文献并分析MSCs治疗脓毒症动物的疗效。主要研究结局为病死率。2名研究者独立筛选相关文献、提取数据并评估偏倚风险。采用固定效应模型的逆方差法,以优势比(odds ratio,OR)为效应量,各效应量以95%可信区间(confidence interval,CI)表示。使用动物实验偏倚风险评估工具(The SYstematic Review Centre for Laboratory animal Experimentation,SYRCLE)评估纳入研究的质量。采用I2和P值评估研究间的异质性,敏感性分析评估结果的稳健性,Begg漏斗图和Egger线性回归评估发表偏倚。STATA 14.0统计软件进行Meta分析。结果1.本Meta分析最终纳入29项动物研究,共1266只动物(包括大鼠、小鼠)。Meta分析结果显示:MSCs明显降低脓毒症的病死率(OR 0.29,95%CI 0.22～0.38,P<0.001),研究间的异质性低(I2=14.5%,P=0.248)。敏感性分析显示,研究结果稳健性好。SYRCLE显示偏倚风险尚不清楚。2.分别从动物种属、模型,脓毒症造模后的MSCs来源、给药剂量、给药时间、给药途径进行亚组分析。结果显示,动物种属:脓毒症造模后给药MSCs明显降低脓毒症大鼠的病死率(OR0.39,95%CI 0.25～0.60,P<0.001);动物模型:MSCs显著降低盲肠结扎穿刺(cecal puncture and ligation,CLP)诱导的脓毒症病死率(OR0.29,95%CI0.20～0.42,P<0.001);MSCs 来源:ADMSCs 显著降低脓毒症的病死率(OR 0.43,95%CI 0.24～0.77,P<0.001);MSCs给药剂量:脓毒症造模后给药1× 106个MSCs剂量降低脓毒症病死率的效果最佳(OR 0.24,95%CI 0.16～0.35,P<0.001);MSCs给药时间:脓毒症造模后1小时给药MSCs降低脓毒症病死率的效果最佳(OR0.28,95%CI0.17～0.46,P<0.001);MSCs给药途径:静脉途径给药MSCs降低脓毒症病死率的效果最佳(OR 0.28,95%CI 0.21～0.38,P<0.001)。结论MSCs治疗显著降低脓毒症的病死率,CLP后1小时静脉给药1×106个ADMSCs能够降低脓毒症大鼠的病死率。因此有必要进一步探讨MSCs治疗脓毒症的相关机制,为今后MSCs治疗脓毒症的临床试验提供强有力的循证医学证据。第二部分:CLP诱导的脓毒症大鼠模型构建及sTNFR1对该大鼠模型ALI的保护作用及其机制研究目的探讨ADMSCs是否通过分泌大量的可溶性肿瘤坏死因子受体1(soluble tumor necrosis factor receptor 1,sTNFR1)改善脓毒症 ALI。方法将120只成年雄性斯泼累格·多雷(Sprague Dawley,SD)大鼠随机分为4组:假手术组(sham control,SC)、CLP 组、CLP 后给予 ADMSCs 组(CLP-ADMSCs)和 sTNFR1 siRNA 注射组(CLP-sTNFR1 siRNA)。CLP-sTNFR1 siRNA 组和CLP-ADMSCs组行CLP处理,CLP后1小时分别经尾静脉注射1×106个敲低和未敲低sTNFR1的ADMSCs。各组大鼠分别于SC或CLP处理后的3、6、24和48小时处死。采用酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测血清中 sTNFR1、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor alpha,TNF-α)、白细胞介素(interleukin,IL)-6和IL-10的水平。开胸取肺组织,以肺湿/干(wet/dry,W/D)重量比检测肺水肿程度,苏木精-伊红染色法(hematoxylin-eosin staining,HE)检测肺组织病理学的改变,TUNEL法检测肺组织细胞凋亡的情况,蛋白质免疫印迹试验(Western Blot,WB)检测肺组织中TNF-α、核因子KB(nuclear factor kappa B,NF-κB)、激活蛋白-1(activator protein-1,AP-1)和 P38 丝裂原活化蛋白激酶(P38 mitogen activated protein kinase,P38 MAPK)的表达,实时荧光定量聚合酶链反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,RT-qPCR)检测TNF-α、NF-κB和AP-1的mRNA表达水平。结果在注射ADMSCs后的6、24和72小时对大鼠进行观察,发现5-乙基-2-脱氧尿苷(5-ethyly1-2 deoxyuridine,EdU)标记的 ADMSCs 在肺中广泛定植。CLP 组肺组织炎性浸润、水肿和出血现象明显增多,凋亡细胞比例增加,而ADMSCs治疗改善了这些异常,但这种作用可被sTNFR1 siRNA处理所减弱。CLP组肺组织的W/D重量比高于SC组,ADMSCs治疗降低了 CLP后的W/D重量比,经过sTNFR1 siRNA处理则消除了这一作用(P均<0.05)。与其它组相比,CLP-ADMSCs组血清中sTNFR1和IL-10的水平最高,SC组的水平最低(P均<0.05)。与SC组相比,CLP组TNF-α和IL-6水平明显升高,而ADMSCs可逆转炎症因子的升高,但这种作用可被sTNFR1 siRNA处理所减弱(P均<0.05)。肺组织WB和RT-qPCR结果均显示,CLP组TNF-α、NF-κB、AP-1等表达均高于SC组;ADMSCs治疗可逆转CLP引起的促炎因子高表达,经过sTNFR1 siRNA处理又消除了这一作用。此外,各组的肺细胞凋亡比例、肺水肿水平与IL-6水平呈现一致性的改变。结论ADMSCs可通过分泌sTNFR1减轻炎症反应和ALI,这为MSCs治疗脓毒症提供了一种潜在的可能机制。第三部分:ADMSCs治疗CLP诱导的脓毒症大鼠ALI的代谢组学研究目的通过代谢组学探讨ADMSCs对CLP诱导的脓毒症大鼠ALI的治疗作用机制。方法将60只成年雄性SD大鼠随机分为3组:SC组、CLP组、CLP-ADMSCs组。CLP-ADMSCs组行CLP处理,术后1小时静脉注射1×106个ADMSCs。各组大鼠分别于假手术或CLP处理后的24小时处死;取肺组织进行HE染色,血清进行ELISA试验,血浆进行代谢组学分析。采用主成分分析法(principal component analysis,PC A)和正交偏最小二乘判别分析法(orthogonal partial least squares discriminant analysis,OPLS-DA)进行判别分析,结合单变量统计分析筛选重要的差异代谢物。结果CLP后TNF-α和IL-6水平明显升高,而ADMSCs可明显降低这些炎症因子的水平(P均<0.05)。各组肺组织学变化与IL-6水平呈现一致性改变。与假手术组相比,脓毒症大鼠在造模24小时后,血浆和肺组织的代谢轮廓发生了明显的变化,且该变化可被ADMSCs所逆转。血浆中发现了 22个主要差异性代谢物,即肌酐、三甲基甘氨酸、苏氨酸、维生素B3、胸腺嘧啶、肌酸、同型半胱氨酸、乙酰胆碱、L-蛋氨酸、多巴胺、组氨酸、苯丙氨酸、维生素B6、L-酪氨酸、精胺、脱氧胞苷、胞苷、黄苷、溶血磷脂酰胆碱(lysophosphatidylcholine,LPC)(包括lysoPC(20:4),lysoPC(22:6))、磷脂酰胆碱(phosphatidylcholine,PC)(包括PC(38:6))、苯丙酮酸;肺组织中发现了 1 1个主要差异性代谢物,即左旋缬氨酸、肌酸、乙酰胆碱、谷氨酸、黄嘌呤、色氨酸、胞苷、LPC(lysoPC(18:3),lysoPC(22:4))、鹅去氧胆酸。对这些生物标志物进行生物学分析,并通过检索代谢组学相关数据库及查阅相关文献构建了相关的代谢网络。结果显示,脓毒症大鼠主要引起氨基酸、甘油磷脂等代谢通路的异常,这些代谢途径与能量消耗、炎症反应、氧化应激等密切相关,而ADMSCs治疗可以逆转上述改变。结论脓毒症大鼠发生氨基酸和甘油磷脂代谢通路的紊乱,而ADMSCs可通过逆转此改变而改善ALI。第四部分:ADMSCs治疗CLP诱导的脓毒症大鼠ALI的肠道微生态研究目的通过16S rDNA探讨ADMSCs对CLP诱导的脓毒症大鼠ALI的治疗作用机制。方法将60只成年雄性SD大鼠随机分为3组:SC组、CLP组、CLP-ADMSCs组。CLP-ADMSCs组行CLP处理,术后1小时静脉注射1×106个ADMSCs。各组大鼠分别于假手术或CLP处理后的24小时处死。为了检测肠道菌群对脓毒症ALI的影响,分别取肺组织进行HE染色,提取血清进行ELISA试验检测炎症因子,收集肠道粪便进行16S rDNA分析。结果CLP后脓毒症大鼠TNF-α和IL-6水平明显升高,而ADMSCs可明显降低这些炎症因子的水平(P均<0.05)。各组肺组织学变化与IL-6水平呈现一致性改变。ADMSCs治疗显著提高脓毒症大鼠肠道菌群的多样性。主坐标分析(principal coordinates analysis,PCoA)结果显示,CLP-ADMSCs 组与 CLP 组大鼠的肠道菌群结构具有显著差异(P=0.001)。此外,PCA与PCoA分析结果一致(P=0.001)。脓毒症大鼠肠道内与能量消耗相关的拟杆菌门细菌,以及与产脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)相关的致病菌埃希氏菌-志贺氏菌的比例均增加;与可调节肠道内粘膜厚度及维持肠道屏障功能相关的阿克曼菌属细菌,以及与能量储存有关的厚壁菌门(如疣微菌科)的比例均降低。这些菌群结构的改变打破机体能量平衡,加重炎症反应,导致肠道屏障功能障碍进而促进肠菌易位。而ADMSCs干预可以逆转上述脓毒症大鼠菌群结构的改变,即增加有益菌、降低有害菌比例,使肠道菌群结构正常化,从而改善脓毒症ALI。结论ADMSCs可能通过调节肠道菌群改善脓毒症ALI。总结我们首先通过Meta分析确定了 MSCs可显著降低脓毒症动物(包括大鼠、小鼠)的病死率,以及ADMSCs能够降低脓毒症大鼠的病死率。其次,采用CLP建立脓毒症大鼠模型进行基础研究。研究发现,ADMSCs可通过分泌sTNFR1竞争性结合TNF-α,阻断TNF-α效应,从而下调NF-κB,AP-1,P38 MAPK等因子活性,最终减轻炎症反应。脓毒症大鼠主要发生氨基酸、甘油磷脂等代谢通路的异常,这些代谢途径与能量消耗、炎症反应、氧化应激等密切相关。脓毒症大鼠肠道内与能量消耗相关的拟杆菌门细菌,以及与产LPS相关的致病菌埃希氏菌-志贺氏菌的比例均增加。与可调节肠道内粘膜厚度及维持肠道屏障功能相关的阿克曼菌属细菌,以及与能量储存有关的厚壁菌门(如疣微菌科)的比例均降低。这些菌群结构改变打破机体能量平衡,加重炎症反应,导致肠道屏障功能障碍进而促进肠菌易位。而ADMSCs能够逆转脓毒症大鼠的代谢通路异常和肠道菌群紊乱。总之,ADMSCs可通过以上途径改善脓毒症ALI。该研究为从干细胞旁分泌角度深入研究脓毒症的治疗、临床上脓毒症早期ALI的严重程度判断提供了基础理论依据,为干细胞治疗脓毒症的临床试验提供了强有力的循证医学证据,对从调节肠道微生态的角度研究脓毒症的治疗亦具有重要的借鉴意义。