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目的:(1)揭示在年老心脏微血管内皮细胞(CMECs)中,BDNF通过Trk B-T1传导促移行信号下游可能的功能蛋白及相关机理;(2)证明Willin是Trk B-T1下游招募的作用蛋白;(3)揭示年老CMECs使用BDNF-Trk B-T1-Willin信号通路促进其移行的作用机制;(4)探索BDNF对年老CMECs的形态特征等的影响;(5)对BDNF促进年老CMECs移行其他可能的通路进行预测分析。方法:利用免疫共沉淀(Co-IP)、双分子荧光互补技术(BIFC)和BIFC竞争性结合技术证明Trk B-T1蛋白能与Willin蛋白相互作用;通过划痕及Time-lapse技术结合图像分析方法,统计研究BDNF对年老CMECs移行的影响;使用q PCR、WB等方法研究BDNF作用于年老CMECs的信号通路及作用机制;利用细胞免疫荧光等研究YAP蛋白的动态变化;利用Ingenuity Systems Pathway Analysis(IPA)生物信息学系统对BDNF促进年老CMECs移行的可能通路进行预测。结果:(1)使用Co-IP体外验证Trk B-T1蛋白能与Willin蛋白结合、在细胞内活性状态下通过BIFC技术和BIFC竞争性结合的实验验证Trk B-T1蛋白与Willin蛋白可以相互作用,即三重验证Trk B-T1能与Willin结合,Willin是Trk B-T1的下游功能蛋白。(2)通过Time-lapse对过表达Trk B-T1的293T细胞和年老CMECs进行伪足运动的研究,发现BDNF能显著地促进伪足的运动速度和位移增加;利用si RNA对CMECs和293T(过表达Trk B-T1)两种细胞的Willin蛋白进行沉默并研究其伪足运动,发现BDNF失去促进伪足运动的能力。结果揭示BDNF是通过Trk B-T1-Willin刺激细胞伪足运动加快而增强细胞的移行能力。(3)利用划痕实验证明:BDNF能够显著提高年老CMECs细胞的移行(p<0.05),但沉默Willin后,BDNF对其移行促进作用不明显;用Anti-Trk B-T1预处理后的年老CMECs细胞,BDNF同样不能促进其移行;用Anti-Trk B-T1预处理后再沉默Willin的年老CMECs细胞,BDNF不发挥促移行作用。综上说明BDNF-Trk B-T1-Willin是BDNF传导并实现促移行的重要通路。(4)通过对F-actin的细胞免疫荧光和Time-lapse图像分析,发现BDNF能使年老CMECs形态特征产生一系列改变从而影响其运动能力:BDNF能够促进细胞F-actin的数目和粗细增加;BDNF能近一倍地提高CMECs的极化能力;BDNF能够使CMECs细胞核的位移速度增加;BDNF能够增加CMECs的贴壁面积;(5)q PCR与WB结果证明BDNF-Trk B-T1-Willin能够激活Hippo通路。q PCR结果显示,BDNF处理过表达Trk B-T1的293T细胞,能够使Hippo信号通路中Willin、MST1、MST2的表达量显著上升(p<0.05);在年老的CMECs中,BDNF能够使Hippo信号通路相关基因Willin、MST1/2、LATS1/2和YAP的表达量显著上升(p<0.05);WB结果也证明了BDNF能使年老CMECs的YAP磷酸化水平下调。(6)通过YAP细胞免疫荧光和对核、质蛋白YAP的WB结果表明:BDNF-Trk B-T1-Willin激活Hippo是通过最终影响YAP的磷酸化来实现的。YAP的细胞免疫荧光证明,BDNF能使胞浆磷酸化的YAP去磷酸化入核,维持核内外均衡水平;核质蛋白的WB结果证明加BDNF处理后,核内的YAP及细胞浆的p YAP蛋白的磷酸化和去磷酸化水平均受到显著影响。结论:(1)Trk B-T1能与Willin结合相互作用,且Willin是BDNF-Trk B-T1通路促移行的下游功能蛋白;(2)BDNF通过BDNF-Trk B-T1-Willin信号通路传导促年老CMECs(OCMECs)移行信号;(3)BDNF通过BDNF-Trk B-T1-Willin通路使呈极化状态的年老CMECs细胞数目增加、细胞中F-actin数目增加且纤维变粗,从而增强其运动趋势;(4)BDNF-Trk B-T1-Willin通路能够激活其下游的Hippo通路,使YAP入核量增加,激活下游功能基因的表达,促进年老CMECs细胞的移行;(5)通过IPA分析平台揭示了:BNDF除了能通过BDNF-Trk B-T1-Willin通路最终激活Hippo通路的YAP磷酸化实现信号传导,这与本研究验证结果相符,还有可能是Trk B-T1间接作用于calpain、SRC或PRKCB去改变细胞的运动能力。