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背景中医学理论认为,肾精亏虚则精不化气,导致正气不足,机体抵御外邪能力下降,所以免疫功能低下是肾精亏虚证的必然表现。但“肾精”生物物质基础及作用机制至今不明。课题组前期研究发现:（1）促红细胞生成素（EPO）与“肾精”的内涵有高度的相似性,提出“EPO可能是肾精的重要生物学物质基础”的假设,并得到初步验证;（2）阴阳双补,益肾填精的名方右归饮有提高免疫功能的作用。但右归饮是否能提高肾虚免疫低下大鼠巨噬细胞的吞噬功能,及其作用机制是否与EPO相关,不得而知。本文拟观察右归饮对肾虚免疫低下大鼠巨噬细胞吞噬功能的影响,及其与EPO信号通路的相关性。本研究得到国家自然科学基金面上项目（81473549）的支持。目的探究右归饮对肾虚免疫低下大鼠巨噬细胞吞噬功能是否具有改善作用,及其作用机制是否与EPO信号通路相关。方法1.腺嘌呤所致肾虚免疫低下大鼠模型的复制、评价与检测方法（1）模型复制:雄性SD大鼠150 mg·kg-1腺嘌呤灌胃连续14天,末次灌胃后6 h尾静脉取血,采用BS220生化仪检测CREA、UREA,采用ELISA法检测ACTH、CORT、T、IgG、IgM、T3、T4、C3、C4。自第15天起,每2天给予1次腺嘌呤维持造模30天。（2）模型成功标准:与溶剂对照大鼠组平均值相比,第14天每只造模大鼠血清中CREA、UREA显著增加,ACTH、CORT、T、IgG、IgM、T3、T4、C3、C4显著减少,判定为该只大鼠模型成功。模型成功的大鼠用于后续试验。2.右归饮对肾虚免疫低下大鼠巨噬细胞吞噬的改善作用及与EPO相关性研究（1）分组及给药:将造模成功的大鼠随机分为模型组、rhEPO 500 IU·kg-1组、右归饮10 g·kg-1、20 g·kg-1、40 g·kg-1组,每组10只。另设对照组10只。各组大鼠行均衡性检验无显著性差异后方可给予药物。右归饮组灌胃给药每天1次,rhEPO注射给药每3天1次,连续30天,第31天处死。（2）宏观考察:动物外观形态,肾脏组织形态变化。（3）脾脏巨噬细胞吞噬检测:尾静脉注射荧光微球后分离脾脏,检测脾脏荧光强度。（4）腹腔巨噬细胞吞噬检测:非刺激法获取腹腔巨噬细胞,比色法检测吞噬中性红能力。（5）骨髓巨噬细胞吞噬检测:细胞因子诱导法获取骨髓巨噬细胞,比色法检测吞噬中性红的能力;倒置荧光显微镜检测巨噬细胞吞噬荧光微球、细菌的情况;计算巨噬细胞玫瑰花环形成率。（6）Western Blot法检测骨髓巨噬细胞EPO通路蛋白HIF-1α、EPO、EPOR、p-EPOR、JAK2、p-JAK2、ERK、p-ERK、C/EBPβ、p-C/EBPβ、PPARγ的表达量。3.右归饮对RAW264.7巨噬细胞吞噬能力的影响及与EPO的相关性研究（1）采用MTT法检测右归饮对RAW264.7巨噬细胞活性的影响。（2）缺氧缺糖法制作RAW264.7巨噬细胞损伤模型。（3）采用慢病毒转导法敲除RAW264.7巨噬细胞的EPO基因。（4）吞噬检测:比色法检测吞噬中性红的能力;流式细胞术检测吞噬荧光微球的能力;显微镜检观察吞噬GFP-E.Coli J96细菌,以及玫瑰花环形成能力。（5）Western Blot法检测细胞EPO通路蛋白HIF-1α、EPO、EPOR、p-EPOR、JAK2、p-JAK2、ERK、p-ERK、C/EBPβ、p-C/EBPβ、PPARγ的表达量。结果1.腺嘌呤所致肾虚免疫低下大鼠模型复制成功且其巨噬细胞吞噬能力显著下降与对照组比,模型组大鼠（1）身材短小,弓背蜷缩,体重减轻,畏寒扎堆,毛色发黄,缺乏光泽;（2）肾脏切片显示空泡较多,肾单位减少,肾小管扩张,肾小球不饱满,肾组织炎性细胞浸润显著;（3）肾虚指标:血清CREA、UREA含量显著上升,ACTH、CORT、T3、T4、T含量显著下降（均P<0.05）;（4）免疫指标:血清IgG、IgM、C3、C4含量显著降低（均P<0.05）;（5）巨噬细胞观察:腹腔巨噬细胞吞噬中性红OD值显著下降;骨髓巨噬细胞吞噬中性红OD值显著降低;吞噬荧光微球、细菌平均荧光强度均显著减少;玫瑰花环形成率显著下降（均P<0.05）。2.腺嘌呤所致肾虚免疫低下模型大鼠EPO及巨噬细胞EPO通路显著下调与对照组比,模型组血清EPO含量明显减少（P<0.05）;巨噬细胞EPO通路相关蛋白EPO、EPOR、p-JAK2、ERK、p-ERK、p-C/EBPβ、PPARγ的相对表达量及p-JAK2/JAK2、p-ERK/ERK、p-C/EBPβ/C/EBPβ的比值显著下降（均P<0.05）。3.右归饮显著逆转腺嘌呤所致肾虚免疫低下大鼠体质及巨噬细胞吞噬能力降低与模型组相比,右归饮各剂量组大鼠（1）体重增加,弓背减轻,精神好转,颇为好动,较少脱发,光泽较好。（2）右归饮10 g·kg-1、20 g·kg-1组肾脏切片空泡数量减少,肾单位增多,扩张的肾小管较多缩小,肾小球囊腔缩小,肾组织炎性浸润减轻。（3）右归饮10 g·kg-1、20 g·kg-1组大鼠血清肾功能指标UREA、CREA含量显著性下降,右归饮10 g·kg-1、20 g·kg-1、40 g·kg-1组血清内分泌指标CORT、ACTH、T3、T4、T含量均有不同程度的上升（均P<0.05）。（4）右归饮各剂量组血清免疫球蛋白IgG、IgM、补体C3、C4含量均有不同程度的增加（均P<0.05）。（5）右归饮10 g·kg-1、20 g·kg-1组腹腔巨噬细胞吞噬中性红的OD值显著升高;右归饮20g·kg-1组脾脏巨噬细胞吞噬荧光微球平均荧光强度显著增加;右归饮各剂量组骨髓巨噬细胞吞噬中性红OD值及荧光微球平均荧光强度显著升高;右归饮20 g·kg-1组、40 g·kg-1组吞噬细菌平均荧光强度显著增强;右归饮各剂量组玫瑰花环形成率均显著上升（均P<0.05）。4.右归饮显著逆转腺嘌呤致肾虚免疫低下大鼠血清EPO的降低及巨噬细胞EPO通路的下调与模型组相比,右归饮10 g·kg-1、20 g·kg-1、40 g·kg-1组血清EPO浓度显著增加（均P<0.05）;右归饮10 g·kg-1、20 g·kg-1、40 g·kg-1组巨噬细胞EPO通路蛋白EPO、EPOR、p-JAK2、p-ERK、p-C/EBPβ、PPARγ相对表达量及p-JAK2/JAK2、p-ERK/ERK、p-C/EBPβ/C/EBPβ比值显著升高（均P<0.05）。5.右归饮显著提高正常、缺氧缺糖损伤的RAW264.7巨噬细胞吞噬能力（1）右归饮对正常RAW264.7巨噬细胞试验结果:与对照组相比,右归饮200μg·mL-1、400μg·mL-1、800μg·mL-1、1600μg·mL-1组细胞吞噬中性红OD值显著增加;右归饮400μg·mL-1、800μg·mL-1组吞噬荧光微球、细菌的吞噬百分率及平均荧光强度显著升高;右归饮400μg·mL-1组玫瑰花环形成率显著上升（均P<0.05）。（2）右归饮对缺氧缺糖损伤RAW264.7巨噬细胞试验结果:与对照组相比,模型组细胞吞噬中性红OD值、荧光微球吞噬百分率、细菌平均荧光强度和玫瑰花环形成率均显著降低（均P<0.05）。与模型组相比,右归饮800μg·mL-1组吞噬中性红OD值、荧光微球吞噬百分率均有显著性升高;右归饮各组吞噬细菌平均荧光强度显著上升;右归饮400μg·mL-1、800μg·mL-1组玫瑰花环形成率显著升高（均P<0.05）。6.右归饮通过EPO及其信号通路调节RAW264.7巨噬细胞的吞噬能力（1）右归饮对EPO基因敲除RAW264.7巨噬细胞试验结果:与对照组相比,EPO基因敲除组细胞吞噬中性红的OD值显著减少;吞噬荧光微球的吞噬百分率显著下降;吞噬细菌的平均荧光强度显著减弱;玫瑰花环形成率显著降低（均P<0.05）。与E PO基因敲除组相比,EPO敲除+右归饮组吞噬中性红、荧光微球、细菌的能力无显著差异（均P>0.05）;玫瑰花环形成率显著升高（P<0.05）与对照+右归饮组相比,EPO敲除+右归饮组吞噬中性红的OD值显著减少;吞噬荧光微球的吞噬百分率显著下降;吞噬细菌的平均荧光强度显著减弱;玫瑰花环形成率显著降低（均P<0.01）。（2）右归饮对正常RAW264.7巨噬细胞试验结果:与对照组相比,右归饮组细胞EPO通路蛋白HIF-1α、EPO、p-EPOR、p-JAK2、p-ERK、p-C/EBPβ、P PARγ表达量及p-EPOR/EPOR、p-JAK2/JAK2、p-ERK/ERK、p-C/EBPβ/C/EBPβ比值显著上升（均P<0.05）。（3）右归饮对缺氧缺糖损伤RAW264.7巨噬细胞试验结果:与对照组相比,缺氧缺糖损伤模型组EPO通路蛋白HIF-1α、EPO、EPOR、p-JAK2、ERK、p-ERK、p-C/EBPβ、PPARγ表达量及p-JAK2/JAK2、p-C/EBPβ/C/EBPβ比值均显著减低（均P<0.05）。与缺氧缺糖损伤模型组相比,右归饮800μg·mL-1组EPO通路蛋白HIF-1α、EPO、EPOR、p-EPOR、JAK2、p-JAK2、p-E RK、C/EBPβ、p-C/EBPβ、PPARγ表达量及p-EPOR/EPOR、p-JAK2/JAK2、p-ER K/ERK、p-C/EBPβ/C/EBPβ比值显著性增高（均P<0.05）。结论1.采用本文方法复制的腺嘌呤大鼠模型,具有显著的肾功能与内分泌的紊乱（肾虚表现）和免疫功能显著降低、巨噬细胞吞噬能力显著降低;同时伴有血清EPO含量的显著下降,巨噬细胞EPO信号通路蛋白表达显著下调;2.右归饮能显著改善上述肾虚免疫低下大鼠的体质及免疫功能的低下,其作用机制与升高血清EPO含量,上调巨噬细胞EPO信号通路,从而增强其吞噬能力相关;3.右归饮对RAW264.7巨噬细胞的吞噬功能具有显著的调节作用,其机制与调控EPO信号通路相关;4.阴阳双调、补肾益精名方右归饮治疗肾虚免疫低下的生物学作用机制与EPO相关,对于“EPO可能是肾精的重要生物学物质基础”的假说具有佐证意义。