论文部分内容阅读
几丁质脱乙酿化酶(chitindeacetylase,Cda)属于碳水化合物酯酶第4家族(CE-4s),它可以将真菌细胞壁中的几丁质转化为去乙酰化程度不同的壳聚糖。根据作用方式的不同,几丁质脱乙酰化酶被分成两种类型,一种是以多点作用机制进行去乙酰的外脱酶,一种是以多链作用机制进行去乙酰的内脱酶。当入侵宿主细胞时,某些致病真菌将分泌几丁质脱乙酰化酶,使自身细胞壁中的几丁质组分发生不同程度的去乙酰化,从而防御宿主细胞中几丁质酶的降解,保护自身细胞壁结构的完整性。为了探究几丁质脱乙酰化酶在灰盖鬼伞生长发育过程中所起的作用,我们利用毕赤酵母真核表达系统对灰盖鬼伞中的几丁质脱乙酰化酶进行异源重组表达,并成功得到了四种具有去乙酸化活性的几丁质脱乙酸化酶(chitindeacetylase,Cda),分别为顶端表达量高的Cda2和429,酶活性分别为0.06 × 10-6 U/mg和0.03 × 10-6 U/mg;基部表达量高的Cda1和884,酶活性分别为1.08× 10-6U/mg和0.35× 10-6U/mg。我们选用酶活相对较高的Cda1和Cda2为研究对象,利用阴离子高效液相色谱(HAPEC-PAD)和Q-TOF-MSMS连用的技术,研究Cda1和Cda2对几丁质寡糖(dp1-6)的脱乙酰化方式,发现这两种酶对N-GlcNAc没有去乙酰化活性,对几丁质二糖具有部分去乙酰化活性。Cdal较容易脱去(GlcNAc)2非还原端的乙酰基,(G1cNAc)3中间和非还原端的乙酰基,(GlcNAc)4-6中间乙酰基去除后,容易脱去非还原端的乙酰基;而对于Cda2来说,较容易去除(GlcNAc)2还原端的乙酰基,(GlcNAc)3中间和还原端的乙酰基,(GlcNAc)4-6中间乙酰基去除后,容易脱去还原端的乙酰基;而且Cdal对去乙酰程度较高的壳六糖显示一定的偏好性,Cda2对多种乙酰化程度不同的壳六糖则显示较弱的去乙酰化作用。接着,对两种酶的三维结构进行了预测,研究发现,Cda1的活性部位+1位置上含有较多的疏水性氨基酸;而在Cda2中,疏水性氨基酸则主要集中在活性部位的-1位置上,这或许在一定程度上解释了这两种酶对几丁质寡糖的作用方式存在的差异性。为了进一步研究这两种酶在菌柄生长过程中所起的生理功能,我们对这两种酶的表达水平进行了分析。经研究发现,Cda1在菌柄非伸长的基部区域表达量较高,Cda2在伸长较快的顶端区域表达量较高,前者的表达量大约是后者的五倍;然后利用3-甲基-2-苯并噻唑酮腙盐酸盐(MBTH)测定菌柄不同区域细胞壁中GlcNAc和GlcN的含量,发现,细胞壁中的GlcN/GlcNAc的摩尔比由顶端的15%增加到基部的22%,表明菌柄细胞壁中含有部分去乙酰化的壳聚糖,并且菌柄细胞壁中的去乙酰化程度从快速伸长的顶端区域到不具有伸长活性的基部区域呈现逐渐升高的趋势,暗示着去乙酰化在菌柄基部细胞壁的成熟过程中起着重要的作用。本研究发现两种几丁质脱乙酰化酶Cda1和Cda2在对几丁质寡糖脱乙酰化的作用方式上以及两者在菌柄不同区域的表达水平上均存在一定的差异,我们猜测这些现象的存在与灰盖鬼伞生长过程中菌柄不同区域的功能存在一定的联系。在伸长生长的菌柄区域,顶端表达量较高的Cda2偏向于脱去游离性几丁质链还原端的乙酰基;在成熟的菌柄区域,基部表达量较高的Cda1偏向于脱去与β-1,3葡聚糖交联的几丁质链的非还原性末端的乙酰基,Cda1的去乙酰化作用打破了细胞壁在可塑性与坚硬度之间的平衡,引起了细胞壁结构的成熟和菌柄伸长生长的终止。