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减数分裂是生殖细胞区别于体细胞的最重要生物学特征,也是进行有性生殖生物性腺发育、配子发生的关键生物学过程,受到了内源性、外源性多因素的精密调控,其失调将会造成肿瘤或生殖障碍,是生命科学领域研究的重要课题。在哺乳类,视黄酸（Retinoic acid,RA）是调控减数分裂起始的关键因子,主要通过诱导生殖细胞中Stra8（Stimulated by retinoic acid gene 8）的表达进行调控。在非哺乳类如鸟类、两栖动物和鱼类中,大量研究证实,RA在减数分裂起始过程中同样具有重要作用。本实验室已有研究表明,RA在鱼类如南方鲇（Silurus meridionalis）、尼罗罗非鱼（Oreochromis Niloticus）减数分裂起始过程中具有重要作用,但Stra8仅存在于少数鱼类如南方鲇,在多数鱼类如尼罗罗非鱼、青鳉（Oryzias latipes）、斑马鱼（Danio rerio）未发现Stra8同源物。因此,在无Stra8的鱼类,RA如何介导减数分裂的起始,迄今仍是未解之谜。减数分裂重组蛋白8（Meiotic recombination protein 8,Rec8）是减数分裂特异的黏连复合物蛋白成分,存在于从酵母到人类的所有进行减数分裂的生物中,其在同源染色体配对、姐妹染色单体的黏连与解离过程均具有重要作用。然而,鱼类Rec8表达、调控及功能如何?目前均缺乏相关研究。鉴于此,本研究以尼罗罗非鱼为对象,研究了两个rec8同源物（分别命名为Onrec8a与Onrec8b）的表达模式及其转录水平、转录后水平调控,并通过过表达对其功能进行了初步探究。具体如下:1 cDNA克隆及序列分析克隆、分析了尼罗罗非鱼rec8,其存在两个复制基因（Onrec8a和Onrec8b）。On Rec8a和On Rec8b分别由589和577个氨基酸残基组成,与其他物种的氨基酸序列一致度为30%以上,两者之间的一致度为36%。On Rec8a和On Rec8b均为Rec8的同源分子,多数鱼类（主要为无Stra8的鱼类）存在两个复制基因,但少数鱼类（有Stra8鱼类）选择性丢失了其中一个。2表达模式尼罗罗非鱼减数分裂起始时间具有明显的雌雄二态性,雌鱼约30 dah（days after hatching）,雄鱼约75 dah。Real-time PCR结果显示,Onrec8a和Onrec8b主要表达于性腺,在精巢,两者均在80 dah表达显著上调,在卵巢,Onrec8a在30 dah开始显著上调,Onrec8b表达水平明显低于Onrec8a,并且仅在40 dah表达上调。原位杂交结果表明,Onrec8a和Onrec8b主要表达于已分化生殖细胞如精母细胞、精细胞中。3表达调控3.1 RA对尼罗罗非鱼精巢组织Onrec8a/b的表达调控AM580是一种选择性的RA受体α激动剂;BMS493是RA受体α、β、γ的泛抑制剂。用AM580、BMS493处理体外培养的40 dah的尼罗罗非鱼精巢组织。结果显示,AM580可显著上调Onrec8a和Onrec8b的表达,而BMS493可抑制Onrec8a和Onrec8b的表达。从而表明,RA可促进Onrec8a和Onrec8b的表达,提示Onrec8a和Onrec8b可能在RA介导的减数分裂起始中均具有作用。3.2转录水平调控（1）5’端上游序列克隆及其荧光素酶报告载体构建及转录活性分析分离克隆了Onrec8a和Onrec8b的翻译起始位点上游3005 bp和2603 bp序列,并分别构建了5个不同长度的荧光素酶报告载体,均具有转录活性,但其大小明显不同。对于Onrec8a,在-283到-2571之间存在正向调控元件,在-2571到-3005之间存在负向调控元件;对于Onrec8b,从-261到-756 bp之间存在正向调节元件,而从-756到-2603之间存在负向调节元件。（2）RA的转录调控RA分别处理Onrec8a与Onrec8b 5个不同长度5’端上游序列的荧光素酶报告载体转染细胞,结果显示,除pr8a-3005luc、pr8a-2571luc、pr8b-261luc外,RA均能显著上调其荧光素酶活性。从而表明,RA可通过直接转录水平调控,上调Onrec8a与Onrec8b的表达。（3）多能性因子、雌激素的转录调控不同条件处理pr8a-3005luc或pr8b-2603luc转染细胞,荧光素酶活性检测结果显示,多能性分子Sox2、Pou5f3及雌激素均显著降低其荧光素酶活性的大小,从而表明,多能性因子、雌激素能下调Onrec8a与Onrec8b的表达。3.3转录后水平调控通过3’RACE的方法分别克隆了Onrec8a和Onrec8b的3’UTR（3’untranslated region）,并构建到荧光素酶报告载体psi CHECKTM-2,分别命名为psi8a-luc和psi8b-luc。荧光素酶活性分析结果显示,尼罗罗非鱼生殖细胞特异的RNA结合分子Dazl与Dnd可显著增强荧光素酶活性。从而表明,Dazl与Dnd可通过转录后水平调控Onrec8a与Onrec8b的表达。4 Onrec8a/b的过表达对细胞周期的影响分别将Onrec8a与Onrec8b构建到由CMV驱动的真核表达载体中,分别命名为p CMV-Onrec8a-Dsred和p CMV-Onrec8b-GFP,转染TES1细胞,荧光显微观察结果显示,Onrec8a和Onrec8b主要定位于细胞核;流式细胞仪检测Onrec8a/b的过表达对细胞周期的影响,初步检测结果显示,Onrec8a和Onrec8b可影响细胞周期,使细胞阻滞在G0/G1期。综上,本研究分离鉴定了尼罗罗非鱼rec8,发现其具有两个复制基因,并且序列分析、时空表达模式、转录水平及转录后水平表达调控的研究结果表明,Onrec8a和Onrec8b的表达模式均与减数分裂相关,并且受到减数分裂起始关键因子RA及其他多种因素的多重调控。该研究为鱼类减数分裂起始的相关研究提供了科学数据与参考。