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炎症性肠病(Inflammatory bowel disease,IBD)是一组肠道炎性疾病的总称,包括溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis,UC)和克罗恩病(Crohn’s disease,CD),发病率呈逐年上升趋势。其发病机制尚不十分明确,但目前认为可能是环境因素(包括饮食、生活方式等)作用于遗传易感者,在肠道菌群的参与下,启动了难以停止的、发作与缓解交替的肠道免疫反应,产生多种促炎因子,导致肠上皮屏障损伤、溃疡经久不愈和炎性增生等病理改变。肠上皮屏障破坏是炎症性肠病的重要病理改变,肠道炎症释放的促炎因子不仅能通过活化免疫细胞抑制微生物的入侵,同时还可影响紧密连接(Tight junction,TJ)蛋白的表达、分布及组成,进而影响肠上皮屏障功能。肠上皮屏障由肠道上皮细胞构建的单层柱状上皮细胞紧密连接紧密连接在一起,肿瘤坏死因子α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)等炎症因子可通过影响细胞骨架调节分子和TJ蛋白重建维持肠上皮屏障,促进肠道上皮细胞凋亡和脱落。肌球蛋白轻链激酶(Myosin light chain kinase,MLCK)是细胞脱落重要的调节因子。鼠实验性结肠炎模型中MLCK表达增加,导致了TJ蛋白下调,上皮屏障功能严重缺失。TNF-α与肠道TJ损伤和肠上皮细胞骨架重塑相关,使肠道通透性增加,同时促进其他炎症因子的释放,如IL-18、IL-17。有研究发现CD和UC患者结肠上皮细胞中Toll样受体(Toll-like receptor,TLR)表达增多,并且暴露于鞭毛蛋白可致TNF-α表达增加进一步损伤肠上皮屏障功能。肿瘤坏死因子样配体1A(Tumor necrosis factor ligand-related molecule1 A,TL1A)是肿瘤坏死家族(Tumor necrosis family,TNF)成员,IBD易感基因,TL1A与其受体死亡受体3(Death receptor 3,DR3)结合,可以启动一系列免疫反应,例如激活T细胞、固有淋巴细胞、单核巨噬细胞、上皮细胞等产生炎症因子TNF-α、IL-17、IFN-γ等。许多研究表明TL1A是粘膜免疫的主要调节因子,连接了固有免疫和适应性免疫,促进炎症因子产生。有研究表明髓系细胞高表达TL1A转基因小鼠回肠杯状细胞增生,且与小肠IL-13升高相关。另有研究表明,人类肠道粘膜组织包含大量记忆性CD4~+T细胞,其中在屏障表面共表达白介素-18受体α(IL-18Rα)和DR3的一种CD4+T细胞,TL1A刺激后可产生IFN-γ、TNF-α、IL-6、IL-5、IL-13、GM-CSF和IL-22。然而TL1A如何调节肠上皮屏障尚不清楚。本实验采用髓系细胞高表达TL1A转基因(FMS-TL1A-GFP-transg-enic)小鼠构建DSS诱导的慢性实验性结肠炎模型,同时应用Caco-2细胞系建立体外肠上皮细胞屏障模型,在动物和细胞水平探讨TL1A在慢性实验性结肠炎中对肠上皮屏障的影响及其机制,以期为IBD的防治提供新的理论依据。具体实验分为以下四部分:第一部分TL1A对慢性实验性结肠炎小鼠肠上皮屏障的破坏作用目的:探讨TL1A对小鼠慢性实验性结肠炎肠上皮屏障的破坏作用。方法:应用髓系细胞高表达TL1A转基因(Tansgenic,Tg)小鼠与C57BL/6野生型(Wild type,WT)小鼠通过饮用葡聚糖硫酸钠(Dextran sulfate sodium,DSS)建立小鼠慢性实验性结肠炎模型,评估小鼠炎症改变,检测肠上皮屏障通透性,透射电镜观察肠上皮屏障破坏情况。结果:与DSS/WT组小鼠相比,DSS/Tg组小鼠结肠炎症更严重,且透射电镜观察发现肠上皮屏障破坏更为显著,肠上皮屏障通透性显著增加。结论:采用髓系细胞高表达TL1A的Tg小鼠和具有相同遗传背景的WT小鼠成功构建了DSS诱导的慢性实验性结肠炎模型;TL1A加重慢性实验性结肠炎模型小鼠的肠道炎症;TL1A可能通过加重肠上皮屏障的破坏、增加肠粘膜通透性促进慢性实验性结肠炎的发生发展。第二部分TL1A破坏慢性实验性结肠炎小鼠肠上皮屏障的体内外机制目的:探讨TL1A高表达对小鼠慢性实验性结肠炎中的肠上皮屏障破坏作用的体内外机制。方法:检测肠组织中TNF-αmRNA含量、TL1A和ZO-1、occludin、Claudin-1,2,3、JAM-A的mRNA表达情况,检测结肠组织中TL1A和ZO-1、occludin、JAM-A、Claudin-1,2,3、MLC、p-MLC、髓样分化因子88(Myeloid differentiation factor 88,MyD88)和TNF受体相关因子6(TNF receptor associated factor 6,TRAF6)的蛋白定量表达。应用慢病毒转染的方法转染Caco-2细胞系,建立体外肠上皮屏障,测定TEER值,FITC-D通透率测定,透射电镜观察Caco-2单层细胞屏障的超微结构。检测Caco-2单层细胞中TL1A和ZO-1、occludin、MLC、p-MLC、MyD88和TRAF6的蛋白定量表达,检测TL1A和ZO-1、occludin的mRNA表达情况。结果:与DSS/WT组小鼠相比,DSS/Tg组小鼠结肠组织中TNF-αmRNA表达显著增加,与DSS/WT组相比,DSS/Tg组小鼠ZO-1、occludin、JAM-A、Claudin-1,3 mRNA表达显著降低,同时ZO-1、occludin、JAM-A、Claudin-1,3蛋白表达降低,Claudin-2、p-MLC、MyD88和TRAF6蛋白表达升高。Caco2+LV-TNFSF15+TNF-α和Caco2+LV-TNFSF15+LPS组分别与Caco2+TNF-α和Caco2+LPS组相比体外Caco-2单层细胞肠上皮屏障通透性显著增加,肠上皮屏障破坏加重,紧密连接蛋白破坏加重,p-MLC、MyD88和TRAF6蛋白表达显著增加。结论:TL1A影响了结肠上皮中TJ的表达;TL1A可能通过TNF-α介导的MLCK/p-MLC通路引起TJ蛋白的表达变化,促进肠上皮屏障的破坏;TL1A可能通过LPS介导的MyD88/TRAF6通路影响TJ蛋白的表达,破坏肠上皮屏障。第三部分ASIV通过修复肠道上皮屏障改善髓系TL1A高表达小鼠的结肠炎症目的:探讨黄芪甲苷(Astragalosides IV,ASIV)对TL1A小鼠慢性实验性结肠炎肠上皮屏障的保护作用及机制研究。方法:应用髓系细胞高表达TL1A转基因(Tansgenic,Tg)小鼠与C57BL/6 WT小鼠通过饮用DSS建立小鼠慢性实验性结肠炎模型和体外Caco-2单层细胞模型,应用ASIV治疗。检测肠上皮屏障通透性,透射电镜观察肠上皮屏障破坏情况、TNF-α的表达变化、紧密连接蛋白及p-MLC、MyD88、TRAF6表达变化。结果:与DSS/Tg组小鼠相比,DSS/Tg/ASIV组小鼠结肠炎症减轻,且透射电镜观察发现肠上皮屏障破坏减轻,肠上皮屏障通透性显著降低,TNF-α表达减少,TJ破坏,p-MLC、MyD88、TRAF6减少。结论:ASIV可能通过促进肠上皮屏障修复缓解慢性结肠炎的发生发展。