猪血凝性脑脊髓炎（Porcine hemagglutinating encephalomyelitis,PHE）是由猪血凝性脑脊髓炎病毒（Porcine hemagglutinating encephalomyelitis virus,PHEV）引起仔猪的一种急性、接触性传染病。PHE具有较高的致死率,且针对该病目前尚无有效的防治措施,极易对养猪业造成危害。溶酶体是一种富含酸性水解酶的泡状样细胞器,主要通过降解内源和外源性大分子物质来维持细胞内的动态平衡。最近一项突破性研究发现,多种β-冠状病毒组装成熟后通过劫持溶酶体进行释放,同时损伤溶酶体,表明溶酶体与β-冠状病毒复制密切相关。PHEV同属于β-冠状病毒,但该病毒致神经细胞溶酶体功能紊乱的作用并不清楚。因此,本研究立足于溶酶体,探究溶酶体功能障碍与PHEV致病的相关性,其研究结果有助于揭示PHEV复制机制。首先,本实验以PHEV感染神经瘤母细胞（N2a细胞）为模型研究PHEV感染对溶酶体功能的影响。利用Western blotting方法检测发现溶酶体相关膜蛋白1（LAMP1）的表达量显著升高,暗示PHEV感染促进溶酶体的生成;以及应用间接免疫荧光方法检测发现病毒能与溶酶体发生共定位,并使溶酶体体积增大,表明PHEV可募集于溶酶体,并改变溶酶体的形态。为了明确溶酶体体积增大是否改变了溶酶体膜的通透性,本研究利用间接免疫荧光技术检测PHEV感染后融合表达的半乳糖凝集素3（GFP-Gal3）与溶酶体共定位情况和组织蛋白酶B（CTSB）的分布情况,以及应用Western blotting检测CTSB在溶酶体腔内外表达变化,结果发现PHEV增加了溶酶体膜的通透性。随后,本实验探究PHEV感染对溶酶体酸性环境的影响,应用荧光探针Lyso Tracker Red DND-99标记PHEV感染48 h后的N2a细胞的溶酶体,发现PHEV感染后溶酶体p H值下降,酸性增强。为探究溶酶体酸性微环境对PHEV生命周期造成的影响,利用空泡型H+-ATP酶抑制剂巴佛洛霉素A1（Baf A1）预处理神经细胞,通过Western blotting和荧光定量PCR检测发现,当溶酶体酸化环境受到抑制时,胞内病毒含量显著降低,表明PHEV复制依赖于溶酶体酸性环境。其次,研究发现多种β-冠状病毒劫持溶酶体以质膜融合调控蛋白Arl8b依赖的胞吐途径将病毒粒子释放到细胞外环境中。为了探究Arl8b在PHEV复制过程中的作用,本研究利用间接免疫荧光技术检测发现PHEV感染后外源性表达的Arl8b（GFP-Arl8b）与病毒粒子聚集在溶酶体上;而收集病毒感染神经细胞后的细胞和上清液,通过Western blotting检测发现过表达Arl8b并不影响PHEV的复制。此外,合成有效干扰Arl8b表达的si RNAs,转染N2a细胞后接种PHEV,发现细胞内病毒含量无明显变化,而胞外病毒含量显著降低,暗示β-冠状病毒PHEV同样以Arl8b依赖的溶酶体胞外途径进行释放。最后,为了深入解析PHEV致神经细胞溶酶体功能紊乱过程中的作用,本研究通过分离成熟溶酶体,利用蛋白质质谱分析,结合生物信息学建立目标蛋白质之间的调控网络,研究PHEV感染对溶酶体蛋白组学变化的影响,筛选PHEV感染致溶酶体功能紊乱的关键靶蛋白。结果筛选得到140个显著差异蛋白,其中表达上调蛋白有49个,表达下调蛋白有91个;对筛选出的差异蛋白进行GO分析和KEGG信号通路分析,构建蛋白-蛋白相互作用网络。该结果表明PHEV感染可致溶酶体功能紊乱,然而这些蛋白在PHEV复制过程中具体机制仍有待进一步研究。综上所述,本研究发现PHEV感染后病毒粒子定位于溶酶体,调控溶酶体形成、形态和活性,并导致溶酶体功能相关蛋白的表达变化。此外,PHEV的复制依赖于溶酶体的酸性环境以及PHEV的释放依赖于质膜融合调控蛋白Arl8b介导的溶酶体胞吐作用,表明PHEV感染导致了溶酶体功能紊乱,并且溶酶体与PHEV的复制密切相关。该研究结果不仅有助于揭示PHEV的致病机制,而且为通过干预溶酶体功能开发潜在抗PHEV药物研究提供研究基础。