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目的：研究弓形虫棒状体蛋白ROP18是否与弓形虫抑制宿主细胞的凋亡有关。方法:利用软件设计扩增ROP18基因的引物，在ROP18基因上游引入Flag标签序列，为方便下游克隆，在上游及下游引物的5’端分别引入BamHⅠ及Hind Ⅲ酶切位点。酚-氯仿法提取弓形虫RH株基因组DNA,，以其为模板PCR扩增ROP18基因。利用试剂盒纯化PCR产物，利用BamHⅠ和Hind Ⅲ双酶切克隆到pcDNA3.1(+)真核表达载体的相同位点，构建pcDNA3.1(+)-Flag-ROP18真核表达载体,DNA序列分析鉴定正确后,大量提取质粒,利用试剂盒去除内毒素，脂质体法转染RAW264.7细胞表达。分离蛋白，SDS-PAGE及利用Flag标签抗体进行Western blotting检测ROP18在RAW264.7细胞中的表达。H2O2分别诱导不含重组质粒的RAW264.7细胞（对照组）、含重组质粒的RAW264.7细胞（转染组）发生凋亡，于24h、48h分别检测以下凋亡指标：细胞爬片经HE染色后显微镜下观察细胞形态的变化，观察细胞是否表现凋亡的特征性形态变化；分离线粒体及细胞浆进行Western blotting检测细胞色素c在线粒体与胞浆中的分布，确定细胞色素C是否从线粒体释放到胞浆；提取细胞基因组DNA进行琼脂糖电泳EB染色后检测DNA是否发生了凋亡特征性的梯状片断化。综合以上实验结果判断弓形虫ROP18蛋白对H2O2诱导的RAW264.7细胞凋亡是否具有抑制作用。结果：DNA序列分析结果显示正确构建了pcDNA3.1(+)-Flag-ROP18真核表达载体，Western blotting检测到ROP18在RAW264.7细胞中的表达。H2O2诱导转染组和对照组RAW264.7细胞凋亡的结果显示：转染组与对照组RAW264.7细胞形态均出现明显的凋亡特征：细胞变圆，细胞膜皱缩，染色质浓缩；Western blotting检测到细胞色素c在线粒体与胞浆中均有分布，说明细胞色素c从线粒体转移至胞浆；DNA出现片断化，可见典型的DNA“梯状”条带，表现均表现凋亡特点。结论:1.成功构建真核表达质粒pcDNA3.1(+)-Flag-ROP18,该质粒在RAW264.7细胞中表达了微量的ROP18蛋白。2.本实验中表达的弓形虫ROP18对H2O2诱导的RAW264.7宿主细胞凋亡无抑制作用。