论文部分内容阅读
目的：探讨经由USP3介导，miR-26a对小鼠正常肝细胞和肝癌细胞增殖过程的差异调控，阐明miR-26a通过其靶基因USP3抑制肝癌细胞增殖的分子机制，为USP3作为肝癌细胞基因治疗靶点提供实验依据。方法：1.实时荧光定量PCR技术检测小鼠正常肝细胞（BNL CL.2）和肝癌细胞（Hepa1-6）miR-26a和USP3的表达水平，以及临床肝癌和癌旁组织病例标本中miR-26a和USP3的表达水平。2.双荧光素酶活性实验验证USP3是miR-26a的直接靶基因。3.小鼠正常肝细胞和肝癌细胞转染miR-26a模拟物以及抑制USP3的慢病毒后，用CCK8比色测定法和3H-TdR同位素掺入法检测小鼠正常肝细胞和肝癌细胞的增殖情况。4. Western blot法检测USP3以及PCNA，MDM2，Cdc25C，Chk1等相关蛋白的表达。结果：1.实时荧光定量PCR检测发现miR-26a表达水平在小鼠正常肝细胞中比肝癌细胞高，USP3表达水平与miR-26a趋势相反。2.通过生物信息学软件TargetScan预测，发现miR-26a在USP3-3’UTR有一段7个碱基完全互补配对。为了验证USP3是miR-26a的直接靶基因，我们构建了含USP3-3’UTR野生型及突变型的报告基因质粒，通过双荧光素酶活性实验发现，miR-26a可显著抑制USP3-3’UTR野生型报告基因质粒的荧光素酶活性而对突变型无显著影响。3.对小鼠正常肝细胞BNL CL.2和肝癌细胞Hepa1-6分别转染miR-26a模拟物（miR-26a mimics）和抑制USP3的慢病毒（LV-shUSP3）后，小鼠正常肝细胞和肝癌细胞的增殖均受到抑制，但对小鼠肝癌细胞的抑制增殖作用更为明显。4. Western blot方法检测结果显示，小鼠正常肝细胞BNL CL.2在转染miR-26amimics或LV-shUSP3后，USP3和MDM2蛋白表达量明显降低，PCNA蛋白表达量增加，Cdc25C,Chk1蛋白表达量无明显变化；小鼠肝癌细胞Hepa1-6在转染miR-26amimics或LV-shUSP3后，USP3和MDM2蛋白表达量明显降低，PCNA，Cdc25C,Chk1蛋白表达量无明显变化。结论：1. USP3是miR-26a的直接靶基因。2. miR-26a通过靶向调节USP3抑制小鼠正常肝细胞和肝癌细胞的增殖，并且对肝癌细胞的抑制作用更为明显。3. PCNA是miR-26a/USP3产生抑制小鼠正常肝细胞和肝癌细胞的增殖情况差异的一个重要蛋白分子。