再生障碍性贫血（Aplastic anemia，简称再障），是由多种病因、多种发病机理引起的骨髓造血功能衰竭、全血细胞数量减少所引发的，以贫血、出血和感染为主要症状的一组异质性疾病。按照患者是否存在细胞遗传学异常将其分为二大类：先天性再障，和获得性再障。按有无明确诱因又将获得性再障分为继发性和原发（特发）性。在世界各国，由于获得性再障是临床上最为常见的再障类型，发病机制复杂，疗效差，长期生存率低，因而多年来始终是国、内外血液学界的一项重要研究课题。 再障发病机理较为复杂，以往认为再障的发生与造血干细胞损伤、造血微环境缺陷及免疫介导有关，三种机制在不同的患者个体中单独或联合作用，导致造血功能衰竭。近年来，随着免疫学理论方法和造血调控研究的进展，造血干细胞功能调控失常和免疫机制紊乱在再障发病中的作用，已成为再障基础研究方面一个最活跃的领域，研究表明超过70％的原发和继发性再障患者免疫机能紊乱在发病中起了重要作用，因此，继续深入探讨免疫学发病机理具有重要的理论意义和实用价值。 第四军医大学博士学位论文 本文采用流式细胞术，细胞内因子染色，RT－PCR，基因扫描方法研究 重症再障患者骨瞩的T细胞亚群分布和克隆性；利用体外克隆方法分离 CD34”细胞反应性T细胞克隆，研究其表型和在体外的效应功能。结果发 现： l．患者骨闲 CD3“T细胞群中，CD4”细胞 44．9o，CDS”细胞 48．3o， CD4／CDS比例0．93；对照CD3”细胞中，CD4”细胞47．5％，CDS”细胞48．4％， CD4lCDS比例0．98。可见本例再障患者骨髓CD3”细胞亚群的分布状态大 致正常。 2．再障骨髓T细胞群中产生IFN－Y的细胞占529％，分泌IL－4的T 细胞占2．3％，IFN．Y“／IL－4”比率为22．6／l；但是，对照骨髓CD3“细胞中 IFN．Y汀细胞占3 8．5％，IL－4”细胞占5二4％，二者的比率为8．9八。表明本 例重症再障患者骨髓的T细胞群体，发生了显著的1型八型T细胞亚群的 平衡漂移。提示患者骨髓IFN－Y”细胞的数量增多。 3．用RT．PCR技术扩增T细胞群中所有的24个V p亚家族基因表达 产物，发现再障患者和正常对照一样，都存在 TCR Vp基因的高度异质性 表达格局，大多数家族的Vp基因均有不同强度的表达，且表达强度比对 照普遍增高。说明这名再障患者骨髓中存在有高度多样化的多克隆T细胞。 4．将患者和对照的所有24个V p／C p PCR产物标记荧光素后，分 别进行片段长度扫描，发现正常对照的各个Vp／Cp PCR产物在长度扫 描中大都表现为均匀的多峰图形，说明在正常骨髓中，T细胞谱是随机多工＿…＿…………－．、．＿＿…．、＿．．＿＿＿』， 样的，并不存在寡克隆性T细胞的优势扩增。而患者的部分Vp们p产物 的CDR3长度峰形图为主峰图，如V p 3，V p 8，V p 23等，提示取用了 Vp3、Vps、Vp23等基因的T细胞克隆，发生了寡克隆性扩张，表达 这些Vp基因的T细胞在患者骨髓中为优势扩增克隆。 5．将CD3“细胞和CD34“细胞进行自体单向混合淋巴细胞培养14天 后，进行有限稀释和单细胞分离接种，再培养14天后有5孔出现团状或 3 第四军医大学博士学位论文 簇状细胞增殖，表明本实验获得了5株再障骨髓的自身反应性T细胞克隆。 ＊．对5个T细胞克隆分别进行双色流式细胞术，结果发现每株T细 胞克隆都无一例外地呈现高度均一的CD4抗原单阳性表达模式，将这5 株克隆命名为 CXI、CXZ、CX3、CX4和 CXS。 （2）．采用RT－PCR技术，对上述CXI—CXST细胞克隆均分别检测了 24个V p基因家族的表达，电泳图谱显示它们各自都专一地表达了取用了 Vps基因。 （3）．Vps亿p基因的CDR3长度谱型分析的结果显示，各克隆表现一 种特定长度的单峰图象，即 270hp的峰，说明这 5个 V D 8儿 P基因扩增产 物的CDR3大小完全相同，即它们的V p－N－D p－N－J p（p构成完全相 同，有力地证明这5株T细胞都是单一的克隆起源，而且它们共有同一种 ＊C且受体。 （4）．流式细胞分析显示 CX～CXS克隆的 IFN－Y／IL－4表达格局极其相 似，均为优势产生 IFN－Y的 Th 功能性亚群， （5）．CD34“细胞与CXI—CXS分别进行混合培养，ELISA检测发现有 明显的IFN．Y分泌增加，且各自的增加幅度相当；但是，CD34’细胞与 CXI—CXS分别进行混合培养中上清的D－Y分泌水平与克隆单独培养?