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目的:胶质细胞瘤是最常见的中枢神经系原发性肿瘤.因生长部位特殊及多数呈浸润性生长,手术不易全切,放疗和化疗效果不佳,迄今尚无令人满意的治疗方法。越来越多的研究显示,基因治疗有可能成为未来治疗胶质瘤的有效手段。治疗基因表达的特异性和生物安全性是目前制约基因治疗的瓶颈,外源性治疗基因表达的特异性取决于启动其表达的启动子的特异性,已有的组织特异性启动子如骨骼肌的desmin启动子,前列腺组织的M6及PSMA启动子等,只能解决基因靶向性治疗的组织特异性问题,hTERT启动子等只能解决基因治疗增殖特异性的问题,而两种特异性组合可以进一步提高基因治疗的特异性和生物安全性,为基因治疗由理论到实践、由概念到实际应用创造条件。因此,本研究目的是在构建重组增殖细胞核抗原启动子(PCNATAI)及胶质纤维酸性蛋白启动子(GFAPp)的基础上,建立一套可用于恶性胶质瘤基因治疗的增殖和肿瘤细胞特异性操纵系统。方法:在GFAP启动子启动下,借助Cre/LoxP系统去除PCNATAI-LoxP-stop-LoxP中的阻遏序列(stop),实现下游基因在恶性胶质瘤细胞系中以增殖和细胞双重特异性的方式表达。在载体pBluescript SK中插入PCNATAI启动子并在此启动子下游插入两端配备Cre重组酶(Cre)特异性识别位点LoxP的转录终止序列stop,构建成真核表达操纵元件(PCNATAI-LoxP-stop-LoxP);将PCNATAI-LoxP-stop-LoxP插入到增强型绿色荧光蛋白(EGFP)表达载体的EGFP基因上游及荧光素酶报导基因表达载体的荧光素酶基因上游,构建定性(pPCNATAI-stop-EGFP)和定量(p-B-Pstop 和 p-E-Pstop)检测质粒;分别以 pBluescriptKS-Cre 及人基因组DNA为模板,用PCR扩增Cre基因全长编码区及GFAP启动子-1660～+16区,以真核表达质粒pEGFP-1为载体,用Cre基因取代pEGFP-1中的EGFP编码区,同时将GFAP启动子-1660～+16区插入pEGFP-1中Cre基因上游的多克隆位点,构建辅助质粒(pGFAP-Cre),使其可在GFAP启动子的启动下在转染真核细胞时介导Cre表达。在恶性胶质瘤细胞系(TJ905细胞)、永生化非肿瘤细胞系(HEK293细胞)、NGF诱导的PC12细胞系(PC12细胞)及原代培养的大鼠星形细胞中,对pGFAP-Cre/PCNATAI-LoxP-stop-LoxP操纵系统的转录启动效率和特异性进行定性和定量检测;利用RT-PCR技术对pGFAP-Cre及pPCNATAI-stop-EGFP在各被测细胞(系)中的转录产物进行跟踪检测。结果:①经酶切及琼脂糖凝胶电泳鉴定证实,PCNATAI-LoxP-stop-LoxP中各片段的位置、大小及插入方向正确无误,pPCNATAI-stop-EGFP、p-B-Pstop和p-E-Pstop中PCNATAI-LoxP-stop-LoxP的插入位点及方向正确无误,证实PCNATAI-LoxP-stop-LoxP构建成功。②经酶切及琼脂糖凝胶电泳鉴定证实,辅助质粒pGFAP-Cre各片段的位置、大小及插入方向正确无误,测序结果证实插入的GFAP启动子及Cre基因的DNA序列完整无突变。③定性检测结果显示,用pPCNATAI-stop-EGFP单独转染各细胞(系)后均无EGFP表达;当将其与pGFAP-Cre共转染时在PC12细胞、HEK293细胞及原代培养的大鼠星形细胞中亦无 EGFP 表达;但在共转染了 pPCNATAI-stop-EGFP 和 pGFAP-Cre 的 TJ905 细胞中则有EGFP表达并发出绿色荧光。④双荧光素酶定量检测结果显示,单独转染p-B-Pstop 或 p-E-Pstop 时,其 PCNATAI-LoxP-stop-LoxP 在各细胞(系)的转录活性均极低,各细胞(系)间荧光素酶相对活性的差异无统计学意义(P>0.05);当将p-B-Pstop或p-E-Pstop与pGFAP-Cre共转染时,TJ905细胞系中PCNATAI-LoxP-stop-LoxP 的转录效率增加,与单独转染 p-B-Pstop 或 p-E-Pstop 的差异有统计学意义(P<0.001),SV40增强子可使荧光素酶相对活性进一步提高。⑤RT-PCR检测结果显示,在共转染pPCNATAI-stop-EGFP与pGFAP-Cre后,在HEK293细胞和PC12细胞中,均未检出Cre基因及PCNATAI-EGFP转录产物;在原代培养星形细胞中只检出Cre基因转录产物;而在TJ905细胞中同时检出了Cre基因及PCNATAI-EGFP转录产物,且PCNATAI-EGFP转录产物长约600bp,证实PCNATAI下游的stop序列已在同源重组过程中被特异性删除。结论:①单独转染以PCNATAI-LoxP-stop-LoxP为转录调控操纵元件的pPCNATAI-stop-EGFP、p-B-Pstop 或 p-E-Pstop 时,其PCNATAI-LoxP-stop-LoxP中的stop序列可有效阻遏PCNATAI对下游目的基因的转录启动;②将pGFAP-Cre分别与以上三种表达质粒共转染时,前者可有效的去除后三者PCNATAI-LoxP-stop-LoxP中的stop序列,恢复它们对下游目的基因的转录启动活性,实现了下游目的基因表达的增殖和肿瘤细胞双重特异性;③在TJ905细胞中,SV40增强子对该操纵系统的转录启动效率有明显的增强作用,且不影响其增殖和细胞特异性;④RT-PCR检测结果证实在四种被检测细胞中PCNATAI-LoxP-stop-LoxP操纵元件的转录过程完全符合其预定工作原理。