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第一部分CSE干预BEAS-2B细胞株中Klotho基因表达对炎症反应及RIG-I/NF-κB通路的影响目的:慢性阻塞性肺病（chronic obstructive pulmonary disease,COPD）是一种以持续气流受限为特征的可以预防和治疗的疾病,其气流受限多呈进行性发展,与气道和肺组织对烟草烟雾等有害气体或有害颗粒的慢性炎症反应增强有关[1]。长期的烟雾暴露能够诱导肺脏的氧化应激反应,引起细胞的衰老或老化。Klotho是一种抗衰老的蛋白,但越来越多研究显示klotho蛋白具有抗炎作用。有研究表明在衰老的大鼠肾脏,klotho蛋白作为细胞内炎症反应的抑制剂,通过下调视黄酸诱导型基因-I(retinoic-acid-inducible gene-I,（RIG-I）/核因子κB（Nuclear factorκB,NF-κB）信号通路发挥抗炎抗衰老作用,并以细胞内的形式抑制RIG-I,进而抑制白介素-6（interleukin-6,IL-6）的表达。我们推测在COPD中Klotho蛋白通过介导RIG-I/NF-κB通路下调IL-6的表达发挥抗炎作用。本研究使用香烟烟雾提取物（cigarette smoke extract,CSE）稀释在BEAS-2B细胞培养基中,制备COPD细胞模型,通过构建klotho蛋白过表达质粒,转染入CSE干预的细胞中,分别测定klotho基因的表达以及RIG-I、NF-κB、IL-6、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factorα,TNFα）表达变化情况,以明确klotho基因的抗炎作用,及其与RIG-I/NF-κB通路的相互关系。方法:1.细胞培养及CSE干预BEAS-2B人肺上皮细胞株取自美国标准培养收集所,香烟提取物在使用前予以细胞培养基稀释。2.Klotho过表达细胞的制备构建klotho过表达质粒,验证过表达效果,筛选稳定过表达klotho的BEAS-2B细胞株。3.qRT-PCR检测Klotho、NF-kB/p65、RIG-I的mRNA的表达。4.Western blotting检测Klotho、NF-kB/p65、RIG-I蛋白的表达。5.酶联免疫吸附测定（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）法检测IL-6、TNFα的表达。结果:1.klotho基因在CSE干预肺上皮细胞株中的表达降低,而RIG-I、NF-κB、IL-6、TNF-α表达增高 2.与Klotho正常表达组CSE干预细胞株相比,Klotho过表达组IL-6、TNFα、RIG-I、NF-κB表达降低。结论:Klotho蛋白在CSE干预制备的COPD模型肺上皮细胞株BEAS-2B中表达降低,过表达klotho蛋白后IL-6、TNFα、RIG-I、NF-κB表达降低。说明Klotho蛋白在COPD模型细胞株中具有抗炎作用,可能是通过介导RIG-I/NF-κB通路下调IL-6、TNFα的表达发挥抗炎作用。第二部分补肺益肾方对CSE干预BEAS-2B细胞株中Klotho基因表达及炎症相关RIG-I/NF-κB通路的影响目的:慢性阻塞性肺病稳定期的治疗目标是缓解患者症状、改善运动耐力及健康状态,防止疾病进展、预防和治疗急性加重、降低病死率。目前的治疗方法（包括支气管扩张剂,糖皮质激素等）多以改善症状,抗炎为主,很难对抗阻止肺老化的进程。中医理论认为:就COPD而言,中重度慢阻肺患者往往合并肺肾气虚,通过调补肺肾,能够平喘,增加活动耐力,并提高患者免疫功能,增强体质,进而实现减少急性加重次数的目的,这也彰显了中医整体观念治疗的独特优势。我们先前的研究发现,运用补肺益肾膏方治疗稳定期COPD,可改善患者中医临床证候和肺功能,临床应用安全,疗效确切。补肺益肾方中的六味中药（黄芪、人参、熟地、山萸肉、仙灵脾和白术）均有抗炎、抗衰老功效。Klotho蛋白作为抗衰老蛋白,除了具有抗衰老作用,还具有抗炎作用。增强Klotho蛋白表达可以抑制COPD所导致的炎症反应。我们推测补肺益肾方通过调控Klotho基因表达,介导RIG-I/NF-κB通路抑制炎症反应,从而达到治疗COPD的目的。本研究拟通过给予中药补肺益肾方及地塞米松干预COPD细胞模型,运用RT-PCR、western blot检测Klotho、RIG-I、NF-κB的表达,ELISA检测下游通路IL-6和TNFα的表达。方法:1.补肺益肾中药复方的细胞毒性测定:当BEAS-2B细胞全部贴壁生长时,测定补肺益肾中药复方最大无毒剂量。2.q RT-PCR及Western blotting检测中药干预前后Klotho、NF-k B/p65、RIG-I的m RNA及蛋白质的表达,并与地塞米松组及空白对照组相比较。3.ELISA法检测中药干预前后IL-6、TNFα的表达,并与地塞米松组及空白对照组相比较。4.在CSE干预下,使用Si RNA技术干扰klotho的表达后,探究补肺益肾方是否依旧能发挥抗炎作用。结果:1.加入补肺益肾方后,klotho基因在CSE干预肺上皮细胞株中的表达增高,而RIG-I、NF-κB、IL-6、TNF-α表达降低2.补肺益肾方组能够通过上调klotho表达水平进而抑制IL-6、TNFα、RIG-I、NF-κB的表达水平,抑制炎症反应。但其作用弱于地塞米松。3.在CSE干预下,使用Si RNA技术敲低klotho的表达后,补肺益肾方抗炎作用明显减弱。结论:补肺益肾方能促进klotho基因的表达并抑制IL-6、TNFα、RIG-I、NF-κB的表达,说明补肺益肾方有确切的抗炎作用。当敲低klotho后其抗炎作用明显减弱,说明其抗炎作用可能是上调klotho蛋白,通过介导RIG-I/NF-κB通路,下调IL-6、TNFα的表达发挥作用。