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目的:人巨细胞病毒（Human cytomegalovirus,HCMV）,分类上属β疱疹病毒亚科,为双链DNA病毒,其基因组全长约235 kb。HCMV可感染多种人类细胞,包括成纤维细胞、内皮细胞、神经元细胞、单核细胞/巨噬细胞和树突状细胞。HCMV是一种广泛传播的病毒,可在人群中建立终身潜伏感染。据统计,人巨细胞病毒Ig G的血清阳性率在全球人口和育龄妇女中分别为83%和86%。虽然HCMV在健康人群中通常只引起无症状感染,但对先天性感染的新生儿和免疫抑制人群来说,HCMV是一种致命的病原体。先天性感染患儿在其出生或生长过程中常呈现先天性耳聋、神经系统损伤等多种临床表现。虽然关于HCMV感染的研究很多,但迄今为止,HCMV感染的发病机理尚不明确。环状RNA（circular RNA,circ RNA）是一种5’末端和3’末端共价连接在一起形成环状结构的非编码RNA。在1976年,circ RNA首次在被类病毒感染的植物中被发现。但由于其较低的转录丰度及功能的未知,长久以来circ RNA都被认为是RNA拼接过程产生的副产物。慢慢地,越来越多的研究表明circ RNA广泛存在于生物体内,并且具有重要的生物学功能,如作为mi RNA（micro RNA）海绵或蛋白质海绵以及蛋白质“脚手架”。近年来,也有一些关于疱疹病毒与circ RNA关系的研究。卡波氏肉瘤相关疱疹病毒（Kaposi’s sarcoma herpesvirus,KSHV）感染可显著影响人静脉内皮细胞（Human umbilical vein endothelial cell,HUVEC）细胞和MC116细胞（一种KSHV感染的B细胞）的宿主来源circ RNA的转录。这些改变的circ RNA对KSHV感染期间其病毒基因的表达有一定的抑制作用。EBV（Epstein-Barr virus）感染的组织及细胞系中转录产生的circ BART与EBV的致癌性有一定的关系。然而,对于HCMV活动性感染与其宿主细胞来源circ RNA之间关系,现时知之甚少。在本研究中,我们用RNA高通量测序和生物信息学方法对HCMV感染/非感染的人胚肺成纤维细胞（human embryonic lung fibroblast,HELF）中的宿主来源circ RNA转录谱进行研究。对受HCMV活动性感染影响显著的宿主circ RNA进行分析和比较。用RT-PCR和Sanger测序方法对显著改变的circ RNA（circ SP100、circ MAP3K1、circ PLEKHM1和circ TRIO）的转录水平及序列结构进行验证。用northern blot和RT-q PCR对HCMV感染的HELF细胞中的circ SP100转录本的特性进行验证。用RNA反义核酸杂交技术和质谱分析方法鉴别与circ SP100结合到蛋白质,并用Gene Ontology（GO）和Kyto Encyclopedia of Genes and Genome（KEGG）对这些蛋白质到功能进行预测。研究方法:1、通过深度RNA测序并用CIRI进行预测,得到HCMV感染72小时/非感染的HELF细胞中宿主circ RNA转录本图谱。将预测得到的circ RNA与circ Base数据比对,并用ANNOVAR数据库和UCSC对其进行分类。2、根据SRPBM值,用edge R软件差异circ RNA分析。与非感染HELF细胞中的circ RNA,若某种circ RNA的倍数变化大于2（或小于1/2）其且q值小于0.05时,则认为该circ RNA是显著差异变大的circ RNA。用GO分析和KEGG分析来评估这些差异表达的circ RNA的潜在生物学功能。3、用RNase R处理的HCMV感染（72hpi）的HELF细胞的总RNA,通过RT-PCR的方法对选定的4种circ RNA（circ SP100,circ MAP3K1,circ PLEKHM1,and circ TRIO）进行验证。同时用RT-PCR扩增线性SP100和GAPDH作为RNase R非耐受对照。随后对这几个选定的circ RNA进行一代测序验证其具体序列。4、用norther blot和反转录定量PCR（RT-q PCT）来验证circ SP100的特性。用RNA反义核酸纯化技术和质谱分析方法鉴别circ SP100结合蛋白质,并用GO和KEGG分析对这些蛋白质的功能进行预测。结果:1、分别在HCMV感染/非感染的HELF细胞中鉴别到27409种和35515种circ RNA;96%以上的鉴定到宿主circ RNA的反向剪切位点读取值都小于100;超过82%的宿主circ RNA为外显子性circ RNA,其他为为内含子来源或基因间接区段来源circ RNA;Circ RNA在基因组上广泛地转录,且circ RNA的转录方式在两种细胞的基因组上没有体现出区别;除去基因间接区段来源circ RNA外,共有40274种circ RNA,这些circ RNA是由8138种基因通过可变剪切转录而来的。通过与circ Base数据比对发现其中37%的circ RNA有注释,而其他的circ RNA为新发现的circ RNA。2、分析发现有19724种circ RNA在感染/非感染细胞中均存在,有15791种circ RNA仅在HCMV感染细胞中出现,有7685种circ RNA仅在非感染HELF细胞中出现。通过将选择阈值设定在倍数变化大于2（或小于1/2）其p值小于0.05,我们共筛选出283种差异显著的circ RNA。其中184种是显著上升的,99种是显著下调的。GO和KEGG分析表明这些显著差异转录的circ RNA在病毒进入、细胞凋亡和细胞增殖方面有潜在功能。3、RT-PCR结果表明在RNase R处理后,线性SP100和GAPDH转录本水平显著下降,而4种选定的circ RNA转录本水平没有下降。随后将上述PCR克隆并测序。得到circ SP100,circ MAP3K1,circ PLEKHM1和circ TRIO的序列信息,其基因信息与RNA-seq和Circ Interactome数据库一种。同时还证实了这些circ RNA均为外显子circ RNA,且出circ PLEKHM1外,其他三个circ RNA具有多个外显子反向拼接而来。4、Northern blot证实circ SP100与预期一样,为正义转录本,且在HCMV感染后,其转录水平增高。亚细胞组分分离后进行RT-PCR检测,结果表明circ SP100主要定位在细胞质中。分析circ SP100和SP100 m RNA的动力学曲线发现circ SP100的转录水平随HCMV感染而升高,SP100 m RNA的转录水平在HCMV感染前24小时升高,随后其转录水平慢慢降低。5、用RNA反义核酸纯化和质谱分析技术在紫外交联和对照组细胞中分别鉴定得到291种和42种蛋白质。其中34种蛋白质在两组细胞中都存在,257种仅存在于紫外交联组细胞中（含10种HCMV编码的蛋白质）,为circ SP100结合蛋白。约59%的circ SP100结合蛋白定位于细胞质,37%的circ SP100结合蛋白定位于细胞核。6、对这些circ SP100结合蛋白进行KEGG分析发现这些蛋白质主要参与剪切体代谢途径、内质网蛋白加工通路、核糖体代谢通路、吞噬体通路等,表明circ SP100在HCMV感染过程中发挥多种作用。结论:HCMV活动性感染可致宿主细胞circ RNA转录组改变。筛选到283种HCMV感染后转录水平显著变化的circ RNA。鉴定了circ PLEKHM1、circ TRIO、circ SP100和circ MAP3K1四种circ RNA转录本结构。Circ SP100为正义链转录本,主要定位于细胞质中;筛选得到了257种与circ SP100直接结合的蛋白质。