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三叶青(Tetrastigmatis hemsleyanum Diels et Gilg)属于葡萄科(Vitaceae)崖爬藤属(Tetrastigma),是我国珍稀的药用植物,以块根入药,且具有抗肿瘤等功效。三叶青在自然环境下生长缓慢且形成块根的年限较长,很难满足药材市场的需求。另外,植物内生菌是一类存在于植物体内、形态种类多样的微生物类群。在长期进化的过程中,植物内生菌与宿主之间形成了共生、互利的关系。部分植物内生菌对宿主有促进生长,提高宿主的抗盐、抗旱、抗病等作用。本研究所在的实验室前期从三叶青块根中分离获得了多个内生菌,其中内生真菌TH15具有明显的促进三叶青根系生长的作用,但其机理不明。为此,本研究通过ITS分子特征序列首先进一步确认了内生真菌TH15属于瘤痤孢科(Tuberculariaceae)镰刀菌属(Fusarium)。在此基础上,采用全基因组鸟枪法,基于Illumina Hi Seq+pacbio测序平台测定并分析了内生真菌TH15的全基因组序列;结合HPLC-MS和NMR分析,分类鉴别了内生真菌TH15发酵液(代谢物)中的活性成分;同时,利用ELISA酶联免疫反应检测了TH15菌体中玉米赤霉烯酮的含量;最后,选取不同浓度组合的玉米赤霉烯酮添加到MS培养基中,用于培养三叶青组培苗以及黄瓜和玉米种子,观察其对组培苗生长和种子萌发的影响。具体研究结果如下:(1)内生真菌TH15的基因组大小为48.74 Mb,GC含量为47.53%;预测含有28,216个蛋白编码基因,蛋白编码基因序列的总长度为14,200,482 bp;预测重复序列为1,187,939 bp,重复序列含量为2.58%;预测非编码r RNA数目为66、t RNA数目为317,nc RNA的数目为356。此外,碳水化合物活性酶(CAZy)类分析中,GHs所占数目最高为348个,其次是CEs为135个,AAs为114个,GTs为87个,PLs为27个。基因组序列通过KOG分类注释,10.02%的基因是与碳水化合物代谢有关;7.97%的基因参与了次生代谢产物中的分解代谢、细胞运输和生物合成;6.29%的基因与氨基酸的转运和代谢有关;3.23%基因参与了DNA的复制、转录以及能量的生产等;而43.98%的基因是被划分到功能未知区域。基因组序列通过与KEGG数据库比对,存在48个代谢通路,包括与蛋白的信号通路有关;与遗传信息的复制与修复有关;与氨基酸代谢有关;与辅酶和维生素的代谢有关;以及与萜类化合物和聚酮类化合物的代谢有关等。(2)结合HPLC-MS和NMR分析法,定性和定量分类鉴定了内生真菌TH15发酵液(代谢物)中的初级和次级代谢产物,包括生物碱、萜类、氨基酸以及吲哚-3-乙酸(IAA)、吲哚-3-丁酸(IBA)、赤霉素(GA)、脱落酸(ABA)、水杨酸(SA)、玉米素(ZT)等植物激素。通过ELISA法测得内生真菌TH15菌体中玉米赤霉烯酮的含量为1.70±0.02μg/g?FW。(3)在培养基中添加不同浓度的玉米赤霉烯酮(ZEN)、过滤的菌液培养三叶青组培苗,结果显示在MS+IAA 0.5 mg/L+6-BA 0.5 mg/L+过滤的菌液100m L/L培养基、以及MS+IAA 0.5 mg/L+6-BA 0.5 mg/L+ZEN 0.1 mg/L培养基上,组培苗培养30 d后的苗高、根长、鲜重、须根数均优于对照组。培养基中添加0.1 mg/L ZEN和100 m L/L过滤的菌液能促进三叶青组培苗的生长。另外,在MS培养基中添加0.1 mg/L ZEN培养黄瓜种子和玉米种子获得无菌苗,结果显示在1/2MS+6 g琼脂+15 g蔗糖+0.1 mg/L ZEN培养基上,种子萌发7 d后的苗高、根长和鲜重均优于未添加ZEN的对照组。培养基中添加0.1 mg/L ZEN能促进黄瓜和玉米种子苗的生长。本研究结果,为进一步探明内生真菌TH15促进三叶青根系生长的分子机理提供了重要的基础。