【摘 要】
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目的:探讨X线诱导肿瘤细胞释放的外泌体对肿瘤生长及免疫细胞生物学功能的影响。方法:1.应用不同剂量的X线照射小鼠路易斯肺癌（Lewis lung carcinoma,LLC）细胞,Western Blot和细胞克隆形成实验检测辐射对细胞凋亡和活力的影响;Phospho-Histone H2A.免疫荧光染色检测辐射对细胞DNA的损伤;2.超滤法提取经X线辐射和未辐射LLC细胞培养上清中的外泌体。透射
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目的:探讨X线诱导肿瘤细胞释放的外泌体对肿瘤生长及免疫细胞生物学功能的影响。方法:1.应用不同剂量的X线照射小鼠路易斯肺癌（Lewis lung carcinoma,LLC）细胞,Western Blot和细胞克隆形成实验检测辐射对细胞凋亡和活力的影响;Phospho-Histone H2A.免疫荧光染色检测辐射对细胞DNA的损伤;2.超滤法提取经X线辐射和未辐射LLC细胞培养上清中的外泌体。透射电子显微镜（TEM）、马尔文电位分析仪、Western Blot对外泌体进行形态大小及表面标记物鉴定;3.外泌体用PKH67进行荧光标记后与LLC细胞、树突状细胞（dendritic cell,DC）共孵育12h后,荧光共聚焦显微镜观察细胞摄取外泌体的情况;4.Transwell侵袭、迁移实验检测不同处理的肿瘤外泌体对LLC细胞侵袭、迁移能力的影响;5.流式细胞术检测外泌体对体外培养的DC分化和成熟的影响;6.体内实验:皮下接种肺癌LLC细胞,建立荷瘤小鼠模型。经尾静脉注射外泌体,记录肿瘤生长情况;7.接种肿瘤后第21天处死小鼠,剥离肿瘤组织称重,取脾脏组织制备单细胞悬液,流式细胞术检测各组小鼠脾脏DC成熟、T细胞耗竭、调节性Treg细胞特异性表型的表达情况;8.ELISA检测各组小鼠血清IFN-γ的含量。结果:1.随着放疗剂量的增强LLC细胞凋亡相关蛋白PARP、Caspase-3、BAX的表达升高;细胞克隆形成实验显示放疗剂量越大细胞形成的集落越少;共聚焦显微镜显示放疗后LLC细胞核Phospho-Histone H2A染色阳性;2.透射电镜、纳米粒径分析技术和Western Blot结果显示通过超滤法提取的外泌体,形态多为圆形,典型的茶托状,平均直径约在118nm,且表达外泌体表面标志性蛋白CD63、CD9和TGS101;3.共聚焦显微镜观察LLC、DC与外泌体共培养12h后大量PKH67染色阳性的外泌体进入细胞质中;4.Transwell细胞体外侵袭、迁移实验显示非辐射LLC细胞衍生的外泌体（LLC-exo）可以促进LLC细胞的侵袭、迁移,而经X线辐射的LLC细胞衍生的外泌体（RT-LLC-exo）可以抑制LLC细胞的侵袭、迁移;5.流式细胞术结果显示LLC-exo与对照组相比可以抑制DC的分化,且越早加入越能够抑制DC分化,此外,LLC-exo还会抑制DC细胞的成熟,而RTLLC-exo可以促进DC的成熟。6.动物实验观察到,LLC-exo促进肿瘤的生长,而RT-LLC-exo可以抑制肿瘤的生长;流式检测结果显示LLC-exo可以下调脾脏CD11C+DC表面MHC II、CD40分子的表达,而RT-LLC-exo处理的荷瘤小鼠脾脏CD11+CDC的MHC II、CD40分子的表达较对照组显著增多（p<0.05）;此外,LLC-exo可以上调荷瘤小鼠脾脏T细胞的PD-1、TIM-3、BTLA表达以及增加CD4+CD25+Foxp3+Tregs的表达,而RT-LLC-exo可以改善T细胞的耗竭以及降低Tregs的表达;ELISA显示LLC-exo可以下调效应因子IFN-γ,而RT-LLC-exo可增强IFN-γ的表达。结论:辐射LLC细胞衍生的外泌体（RT-LLC-exo）可以抑制肿瘤细胞的侵袭、迁移,且通过增强促进DC细胞的成熟,改善T细胞耗竭,增强T细胞的活化,提示X线处理后肿瘤细胞释放的外泌体具有一定的激活抗肿瘤应答能力。
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