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研究目的:丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）,是丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶家族的一员,作为信号转导酶在免疫应答、细胞迁移和成熟等过程中起着关键作用,尤其是对败血症的发生发展有着及其重要的影响。MAPK信号通路有三个主要成分,分别是ERK1/2、p38和JNK;LPS刺激后可以激活ERK1/2、p38和JNK分子,形成磷酸化的ERK1/2、p38和JNK,并引起其下游的转录因子活化入核,导致多种细胞因子和分子的生成释放。CD38（cluster of differentiation 38）,是分子量45 k Da的II型跨膜蛋白,既可作为环化酶和水解酶催化相关反应,也可作为膜受体发挥作用。本实验室的前期结果表明,LPS诱导后,CD38缺失败血症小鼠模型表现出肾脏组织的病理损伤加重,伴促炎因子（如IL-1β、TNF-α等）的表达显著升高;这与TLR4/NF-κB通路的激活密切相关。但是CD38缺失对MAPK信号通路的影响及MAPK通路在CD38缺失小鼠加重的败血症肺损伤和炎性反应中的作用及机制尚未见报道。因此,我们拟借助大肠杆菌（E.coli）诱导小鼠败血症模型,阐明CD38/MAPK通路在大肠杆菌诱导的小鼠败血症肺损伤中的潜在作用及其机制。研究结果将拓宽我们对CD38调节分子的认识,为MAPK信号通路的调控提供新的理论依据,同时给临床败血症的治疗提供新靶点。研究方法:1.取8周龄雄性WT（野生型C57BL/6）小鼠,用PBS缓冲液将大肠杆菌标准菌株ATCC25922配置成不同浓度梯度的悬液,对小鼠进行腹腔注射,以注射等量PBS缓冲液的WT小鼠作为对照,取出小鼠肺组织,通过H&E染色观察小鼠肺部病理改变,并根据病理改变的程度确定合适的大肠杆菌注射浓度和时间。2.取8周龄雄性WT小鼠,用PBS缓冲液将大肠杆菌标准菌株ATCC25922配置成浓度为3×10~8cfu/m L的悬液,注射0.5m L大肠杆菌悬液建立败血症小鼠模型,注射等量的PBS缓冲液建立对照组小鼠模型,3小时后将小鼠处死,分离其血清和肺组织。3.利用H&E染色比较注射PBS和注射E.coli的小鼠肺组织的病理学差异,借助细菌培养及革兰染色技术确定大肠杆菌是否成功感染小鼠肺组织。4.通过逆转录-聚合酶链式反应（reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR）和实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR）分别检测注射PBS和E.coli后WT小鼠肺组织炎性因子（IL-1β,TNF-α,IL-6和i NOS）,趋化因子MCP-1及其受体CCR2的mRNA表达水平。5.取8周龄雄性WT小鼠、CD38-/-C3H/He N(CD38-/-)和CD38-/-C3H/HeJ(CD38-/-TLR4mut)小鼠,分别注射0.5 m L 3×10~8cfu/m L的大肠杆菌悬液建立败血症模型,3小时后将小鼠处死,分离血清和肺组织。6.通过H&E染色比较注射E.coli后WT、CD38-/-和CD38-/-TLR4mut小鼠肺组织的病理学差异。7.通过RT-PCR和实时荧光定量PCR检测注射E.coli后WT、CD38-/-和CD38-/-TLR4mut小鼠肺组织中的炎性因子（IL-1β,TNF-α,IL-6和i NOS）,趋化因子MCP-1及其受体CCR2的mRNA表达水平。8.通过蛋白印迹技术检测注射E.coli后WT、CD38-/-和CD38-/-TLR4mut小鼠肺组织中MAPK、NF-κB、磷酸化MAPK、磷酸化NF-κB、炎性因子（IL-1β,TNF-α和i NOS）、趋化因子MCP-1及其受体CCR2的蛋白表达水平。9.通过酶联免疫吸附测定技术（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay,ELISA）,检测注射PBS后的WT小鼠、注射E.coli后WT、CD38-/-和CD38-/-TLR4mut小鼠血清中趋化因子MCP-1的含量。研究结果:1.H&E染色结果表明,3×10~8cfu/m L的大肠杆菌悬液经腹腔注射后3小时,可成功诱导小鼠败血症模型。2.细菌培养结果显示,注射PBS的WT小鼠肺组织未能培养出任何可疑菌落;注射大肠杆菌的WT小鼠肺组织中培养出可疑菌落,且经革兰染色鉴定,此可疑菌落为典型的革兰氏阴性杆菌。3.H&E染色结果显示,与注射PBS的WT小鼠比较,注射大肠杆菌的WT小鼠肺组织呈现明显病理损伤。4.与注射PBS的WT小鼠比较,注射大肠杆菌的WT小鼠肺组织促炎因子（IL-1β,TNF-α,IL-6和i NOS）、趋化因子MCP-1及其受体CCR2的mRNA表达水平均显著升高。5.H&E染色结果显示,与注射大肠杆菌的WT小鼠比较,注射大肠杆菌的CD38-/-小鼠肺组织损伤更严重;与注射大肠杆菌的CD38-/-小鼠比较,注射大肠杆菌的CD38-/-TLR4mut小鼠肺组织损伤有明显改善。6.与注射大肠杆菌的WT小鼠比较,注射大肠杆菌的CD38-/-小鼠肺组织促炎因子IL-1β、TNF-α和i NOS,趋化因子MCP-1及其受体CCR2的mRNA水平均显著升高,促炎因子IL-6的mRNA水平无明显改变。7.与注射大肠杆菌的CD38-/-小鼠比较,注射大肠杆菌的CD38-/-TLR4mut小鼠肺组织促炎因子IL-1β、TNF-α和i NOS,趋化因子MCP-1及其受体CCR2的mRNA水平均明显降低,促炎因子IL-6的mRNA水平无明显改变。8.与注射大肠杆菌的WT小鼠比较,注射大肠杆菌的CD38-/-小鼠肺组织中磷酸化MAPK ERK1/2、磷酸化MAPK p38、磷酸化NF-κB p65、IL-1β、i NOS以及MCP-1的蛋白水平均明显升高,但磷酸化MAPK JNK、磷酸化NF-κB p105、MAPK ERK1/2、MAPK p38、MAPK JNK、NF-κB p65、NF-κB p105、TNF-α以及CCR2的蛋白水平均无明显改变。9.与注射大肠杆菌的CD38-/-小鼠比较,注射大肠杆菌的CD38-/-TLR4mut小鼠肺组织中磷酸化MAPK ERK1/2、磷酸化NF-κB p65、IL-1β以及MCP-1的蛋白水平均明显降低,而磷酸化MAPK p38、磷酸化MAPK JNK、磷酸化NF-κB p105、MAPK ERK1/2、MAPK p38、MAPK JNK、NF-κB p65、NF-κB p105、TNF-α、i NOS以及CCR2的蛋白水平均无明显改变。10.与注射PBS的WT小鼠比较,注射大肠杆菌的WT小鼠血清中趋化因子MCP-1含量显著升高;与注射大肠杆菌的WT小鼠比较,注射大肠杆菌的CD38-/-小鼠血清中MCP-1含量进一步显著升高;但与注射大肠杆菌的CD38-/-小鼠比较,注射大肠杆菌的CD38-/-TLR4mut小鼠血清中MCP-1含量显著下降。结论:1.用大肠杆菌标准菌株ATCC25922诱导的小鼠败血症模型建立成功,保证了实验的可靠性。2.注射大肠杆菌之后,WT小鼠肺组织出现明显病理损伤,伴炎性因子、趋化因子以及趋化因子受体的表达增加。3.CD38缺失可通过激活MAPK/NF-κB信号通路增加促炎因子IL-1β、i NOS和趋化因子MCP-1的表达并加重肺组织病理损伤,对于趋化因子受体CCR2的表达无明显影响。4.TLR4突变可在一定程度上通过下调MAPK/NF-κB信号通路活性,抑制CD38缺失引发的促炎因子IL-1β和趋化因子MCP-1表达增强,减轻小鼠肺组织损伤。