论文部分内容阅读
双氢青蒿素（Dihydroartemisinin, DHA）是青蒿素众多衍生物中的一种,拥有着比青蒿素更好的活性，近年来研究表明DHA具有明显抑制肿瘤生长的作用。胆管癌细胞中抗凋亡蛋白Mcl-1(Mcl-1L)成高表达状态，表明胆管癌的发生与Mcl-1的表达失调密切相关。Mcl-1L的mRNA前体经过可变剪接产生截短体Mcl-1S，是一种凋亡控制蛋白，可诱导细胞凋亡。miR-29b表达水平同胆管癌细胞中Mcl-1表达情况密切相关。目的：观察DHA对人胆管癌细胞QBC939是否有确切的诱导凋亡作用，验证凋亡发生是否与转铁蛋白受体（TfR）变化有关，探讨DHA对McL-1表达的影响及其可能机制。方法： MTT及苔盼蓝染色分别检测不同浓度和时间DHA对QBC939抑制率及死亡率的变化影响，并得出最适浓度及作用时间点，以继续以下实验；DNA Ladder及流式细胞术（FCM）检测DHA处理后QBC939凋亡率的变化情况；荧光实时定量PCR（RT-QF-PCR）检测DHA处理后QBC939细胞内TfR、Mcl-1(Mcl-1L，Mcl-1S)相应mRNA以及miR-29b表达及变化情况；Western blot检测TfR以及Mcl-1(Mcl-1L,Mcl-1S)蛋白表达及变化情况。结果： MTT及苔盼蓝染色显示，与对照组相比，实验组DHA可显著抑制QBC939的增殖（P<0.05）并促进其死亡率的增加（P<0.05），两实验均呈时间剂量依赖性，实验证实20μmol/L的DHA在12、24、48h时间段作用效果较明显，且并不会出现大量的死亡细胞影响后续实验指标检查；DNA Ladder及FCM检测表明QBC939凋亡率均显著高于对照组（P<0.01），且呈时间依赖性。同时FCM检测DHA作用后可使QBC939细胞的G0/G1期、G2/M期的细胞减少，细胞被大量阻滞于S期（P<0.01），并诱导部分QBC939发生细胞凋亡；RT-QF-PCR及Western blot检测结果显示，DHA能明显上调QBC939的Mcl-1S、TfR的mRNA和蛋白表达（P<0.01），miR-29b在DHA作用后48h时表达显著增多(P<0.01)，Mcl-1L虽在DHA作用后24h开始表达显著升高，但由于Mcl-1S表达增高远超过Mcl-1L，导致Mcl-1L所占Mcl-1比例显著降低。结论： DHA有确切的诱导QBC939细胞凋亡的作用；DHA并非通过降低TfR表达诱导QBC939细胞凋亡，TfR表达的增高可间接促进胞内钙离子含量的增多，从而增强QBC939细胞对DHA的敏感性；DHA可通过多重机制影响凋亡相关蛋白Mcl-l蛋白的表达，提高Mcl-1S在Mcl-1中表达比例并诱导胆管癌细胞发生凋亡; DHA促进Mcl-1S的表达可能是通过上调miR-29b表达途径完成。