约有80％的病原微生物，是通过黏膜侵入机体引起感染以及相应的系统性疾病。因此，通过黏膜途径的接种免疫是预防传染病的最佳策略。黏膜疫苗能够激活机体的黏膜和系统免疫应答，可以有效的预防病原微生物的侵染。同时，其接种途径更为方便与快捷，是未来疫苗的发展方向。而安全、有效的黏膜佐剂，则是黏膜疫苗研发和应用的关键。　　大肠杆菌热不稳定肠毒素(Heat labile enterotoxin，LT)及其无毒突变体LTm，由于具备较强的免疫原性与优秀的黏膜佐剂活性，得到了广泛的关注与深入的研究。LT及其衍生物能够显著增强机体对抗原的黏膜和系统免疫应答，诱导长期的免疫记忆，消除免疫耐受，调节机体Th1、Th2、Th17以及Treg途径的免疫应答。因此，其在黏膜免疫研究以及黏膜疫苗开发中具有重要的价值。然而，由于其在制备方面存在一定困难，佐剂作用机制尚未完全阐明，阻碍了其在临床研究中的广泛应用。在本篇论文中，我们从LT突变体及其亚基的高效制备、LT佐剂作用机制的探索以及基于LT佐剂疫苗的研发三个方面展开了研究，共分为五个章节。　　(1)发现了佐剂蛋白LTm在工程大肠杆菌中的制备瓶颈。通过构建一系列的重组质粒，比较和分析不同重组菌的表达水平，我们确定了信号序列在LTm以及其亚基的表达中起着关键的作用，是LTm在工程大肠杆菌中的制备瓶颈，并提出了高效制备的LTA和LTB亚基蛋白的策略。　　(2)建立了佐剂蛋白LTm体外制备的方法。通过设计，表达和纯化了LTA、LTB和ALB三种亚基蛋白，设置了LTA-LTB，ALB-LTB两种用于制备LTm的组装体系。探索了温度，pH值，离子强度以及亚基之间的比例等影响组装的因素，并成功在体外装配形成了具备生物活性的六聚体LTm佐剂蛋白。在LTA-LTB装配系统中，最合适的装配条件是在4℃，pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液中，离子强度为0.3，LTA与LTB比例为1∶6-1∶7。在ALB-LTB装配系统中，最合适的装配条件是在4℃，pH为8的磷酸盐缓冲液中，离子强度为0.2-0.3，ALB与LTB比例为1∶1-1∶2。通过这种方法制备的LTm佐剂蛋白产量达到了约80 mg/L。　　(3)发现了LTA亚基A2结构域的细胞穿膜能力，并对其穿膜机制进行了研究。LTA亚基的A2结构域能使与之融合的蛋白，通过A2结构域介导的主动跨膜过程进入到细胞内，同时，A2结构域的跨膜能力适用于多种不同的细胞类型。低温和抑制剂的处理证明了A2结构域的内化是一个能量依赖的过程，并且是通过网格蛋白介导的内吞途径和巨胞饮途径。这些结果解释了单独的LTA亚基的内化，有助于更好地理解LTA亚基作为黏膜佐剂的作用机制。　　(4)解释了LT亚基蛋白在细胞水平激活机体黏膜免疫的原因。通过原核表达系统，分别制备了LTB、LTA以及LTA(192)三种LT的亚基蛋白。LTB能够降低细胞的活力(10％-20％)，诱导的细胞早期凋亡（7.6％-15.1％），并引起细胞形态的变化;LTA能够显著抑制细胞增殖(56.1％-43.9％)，诱发细胞的早期凋亡(14.0％-34.9％)以及晚期凋亡(6.1％-11.3％)，并引起细胞形态的改变。而LTA(192)对细胞无抑制作用并且不能诱导细胞凋亡。同时，亚基蛋白都能够诱导细胞IL-8与IL-18炎症因子基因的表达，并产生相应的炎症因子，LTA作用最为显著，IL-8与IL-18分别达到了103 pg/mL与32 pg/mL。另外，细胞内第二信使cAMP、Ca2+的含量也因蛋白作用有了不同程度的提高，细胞内p50和p65基因表达水平也有了约2倍的提升，NF-κB信号通路被激活。这些结果证明了亚基蛋白在细胞水平是通过诱导上皮细胞的局部炎症反应，进而激活黏膜免疫系统来发挥自身的佐剂活性。　　(5)制备并初步评价了基于LT佐剂的口服三联腹泻疫苗。通过对抗原蛋白的筛选，利用基因工程技术构建了抗原蛋白的原核表达载体，通过大肠杆菌表达体系制备了相应的重组抗原蛋白，并以海藻酸钙-壳聚糖微球为口服载体，制备形成相应口服疫苗的制剂。在小鼠模型中，通过对佐剂蛋白及佐剂组合的评价，筛选出了效果最优的LTB+LTA与LTB+LTA(192)佐剂组合，随后结合抗原蛋白制备了LTA+LTB+StxB+FlaA与LTA(192)+LTB+StxB+FlaA两种疫苗制剂。疫苗免疫小鼠后，能够诱导产生高效价的抗原特异的sIgA抗体与IgG抗体，激活了机体黏膜及体液免疫应答，同时提升了外周血中CD4+T/CD8+T细胞的比率，在一定程度上激活机体的细胞免疫反应，能够对机体起到有效的保护作用。　　综上所述，在本论文的研究中，工程菌中LTm制备瓶颈的发现，以及体外制备LTm方法的建立，为LTm及其亚基的高效制备提供了理论与技术支持;LTA亚基A2结构域的细胞穿膜功能的发现与穿膜机制的研究，以及LT亚基蛋白在细胞水平激活机体黏膜免疫机制的阐明，填补LT佐剂机理的部分空白;基于LT佐剂的口服三联腹泻疫苗的制备与评价，为新型腹泻疫苗的研发提供设计思路与数据支持。