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1研究背景间质性肺疾病(interstitial lung disease,ILD)是一系列可累及肺间质、气道以及肺泡的肺部弥漫性病变,通常在细支气管末端有各类胞外基质沉积及细胞浸润,表现为肺泡-毛细血管功能单元逐渐损伤,其最后的发展结果为弥漫性肺纤维化以及蜂窝肺。ILD目前治疗效果差,病死率高,其中尤其是特发性肺纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis,IPF),其病理生理过程及确切的发病机制尚未完全阐明,目前仍欠缺特异有效的治疗手段以阻止或逆转其病程的进展。目前的研究公认IPF的发病机制为肺泡及支气管上皮细胞的损伤[1-3]。上皮-间质转分化(Epithelial to mesenchymal transition,EMT)在ILD发病机制中的作用得到广泛关注,被认为是肺纤维化的重要特征,其关键的病理生理改变为上皮损伤后在修复过程中所出现的失调现象。气道上皮细胞在各种纤维化因素的诱导下,向间充质细胞(成纤维细胞、肌纤维母细胞等)转分化,上皮细胞之间的连接、粘附结构及极性消失,取而代之的是Ⅰ型胶原和纤维结合素合成增多,同时伴有细胞器异常分布、细胞框架重组等改变。以上各因素成为肺间质纤维化在细胞学层面上发生变化的基础。目前对于肺纤维化EMT的机制尚未完全了解,有相关的研究证实其与EGFR/Akt、TGF-β/Smad等信号转导通路有关[4-5]。明确其中的关键环节,在纤维化早期抑制上皮细胞间质转分化,能够有效遏制ILD的进展。转化生长因子-β(transforming growth factor,TGF-β)是调控细胞增殖、分化及其他功能的重要分子,同时也是是肺纤维化中启动EMT的一个重要因子。有相关研究表明,在组织细胞中TGF-β可通过Smad通路诱导EMT,导致组织器官纤维化的产生[6-7]。在国内外的各项研究中,无论体内实验与离体实验均证实了增强TGF-β的表达可产生EMT过程,出现成纤维细胞的生物学活性,导致肺纤维化的产生。叉头框蛋白(forkhead box protein,FOX)家族是一类参与机体生长发育、新陈代谢等多方面的转录因子,与细胞增殖、凋亡、代谢等功能相关。近年研究表明,FOX家族在细胞上皮-间质转分化过程中起到重要的调控作用[8],叉头框蛋白O3a(forkheadbox protein O3a,Foxo3a)作为家族中一员,可以影响纤维化的进展。研究表明FOXO3a在TGF-β诱导的肾上皮间质转分化中起重要作用[9]。另有研究表明FOXO3a参与了肺纤维化EMT过程,可能与纤维化时FOXO3a对转分化基因Snail抑制减少有关[8]。本课题组前期对肺纤维化的研究表明,应用EGFR-TKI代表药物吉非替尼下调TGF-β通路,可出现FOXO3a表达增加,同时明显减轻博来霉素所致的肺间质纤维化细胞增殖及转分化。本研究推测FOXO3a是EMT过程中的一个关键节点,参与了TGF-β诱导的肺纤维化EMT过程,在肺组织纤维化EMT过程中,通过TGF-β/Smad通路起到关键作用。因此,为进一步研究TGF-β诱导下EMT中的FOXO3a活性变化、FOXO3a对上皮-间质转分化相关基因的转录调控机制,本研究需探讨FOXO3a在肺纤维化上皮-间质转分化过程中的作用,以为后续的研究奠定实验基础。2研究目的2.1采用TGF-β刺激人支气管上皮细胞,评估其上皮细胞表型及间质细胞表型标志物表达变化,建立ILD体外细胞EMT模型。2.2.探讨FOXO3a在细胞EMT过程中表达水平变化。2.3通过基因重组技术,探讨验证了增强FOXO3a的表达在肺间质纤维化EMT中起到的作用,为完善肺纤维化过程中EMT机制、探求抑制肺纤维化治疗新靶点提供新的思路。3方法和材料支气管上皮细胞来源的16HBE细胞由广州军区总医院医学实验科细胞库提供。16HBE细胞在含10%灭活小牛血清的RPMI-1640高糖培养基培养基中,置于二氧化碳恒温培养箱中培养。3.1支气管上皮细胞上皮-间质转化模型的构建3.1.1 TGF-β诱导支气管上皮细胞α-SMA及E-cadherin mRNA和蛋白的表达变化16HBE细胞用含10%FBS的培养基体外培养。取第3代细胞接种于6孔板,10%FBS培养24h后,换1%FBS培养24h,实验分2组处理:(1)对照组;(2)10μg/L TGF-β组.细胞分别培养24h、48h、72h后提取总RNA及总蛋白,PCR及Western Blot检测E-cadherin和α-SMA的表达。3.1.2免疫组化法检测E-cadherin和α-SMA在16HBE细胞上的定位及表达实验方法:16HBE细胞用含10%FBS的培养基体外培养。取第3代细胞接种于6孔板爬片,用含10%FBS的培养基培养24h后,换用含1%FBS的培养基培养24h,分2组处理:(1)对照组;(2)10μg/L TGF-β组.细胞分别培养48h后应用免疫组化技术检测E-cadherin和α-SMA的定位及表达。3.2 PCR、Western Blot检测16HBE细胞EMT过程中FOXO3a mRNA和蛋白的表达16HBE细胞用含10%FBS的培养基体外培养。取第3代细胞接种于6孔板,用含10%FBS的培养基培养24h后,换用含1%FBS的培养基培养24h,分2组处理:(1)对照组;(2)10μg/L TGF-β组.细胞分别培养24h、48h、72h后提取总RNA及总蛋白,PCR检测FOXO3a的表达。3.3增强FOXO3a表达对细胞EMT的影响。3.3.1 FOXO3a质粒的构建及验证。从Gen Bank上获取人FOXO3a基因的序列,设计引物,PCR扩增制备FOXO3a基因片段,按照试剂盒说明书电泳、凝胶,纯化基因片段。利用限制性内切酶消化获得线性化载体,与FOXO3a基因重组并进行转化,取单菌落通过PCR技术鉴定,鉴定合格者进行测序。将验证合格的菌液进行扩大培养,按照质粒小提试剂盒说明书进行质粒提取。3.3.2检测增强FOXO3a表达后,EMT过程中α-SMA、E-cadherin mRN A和蛋白的表达变化。分组为正常对照组,FOXO3a组,阴性质粒组,TGF-β诱导组,TGF-β+FOXO3a组,TGF-β+阴性质粒组。按试剂盒说明书操作进行转染,48h后获取各组总RNA及总蛋白,PCR、Westernblot检测各组α-SMA、E-cadherin mRNA和蛋白表达情况。3.4统计学方法应用spss20.0软件进行数据分析,统计资料以均数±标准差(SX±)表现。各组数值均需先用方差齐性检验,组间均数的对比应用单因素方差分析(One-Way ANOVA)。方差齐时,多重对照应用LSD检验,方差不齐时,多重对照接纳Dunnett′s T3检验,取P<0.05差别有统计学意义。4结果4.1支气管上皮细胞上皮-间质转化模型的构建4.1.1 TGF-β诱导支气管上皮细胞α-SMA及E-cadherin mRNA和蛋白的表达变化10μg/L TGF-β组α-SM A mRNA随时间表达增强,差异有统计学意义(P<0.05);阴性对照组的差别无统计学意义(P>0.05);10μg/L TGF-β组Ecadherin mRNA随时间增加表达减弱,差异有统计学意义(P<0.05);阴性对照组差别无统计学意义(P>0.05)。10μg/L TGF-β组α-SMA蛋白随时间表达表达增强,差异有统计学意义(P<0.05);阴性对照组差别无统计学意义(P>0.05);10μg/L TGF-β组Ecadherin蛋白随时间增加表达减弱,差异有统计学意义(P<0.05);阴性对照组差别无统计学意义(P>0.05)。4.1.2免疫组化法检测E-cadherin和α-SMA在16HBE细胞上的定位及表达免疫组化结果提示,E-cadherin和α-SMA均分布于细胞质中,E-cadherin在正常对照组中高表达,TGF-β(10μg/L)诱导组中,E-cadherin表达明显减弱。正常对照组中低表达的α-SMA,而TGF-β诱导组中,α-SMA的表达增多。4.2 PCR、Western Blot检测16HBE细胞EMT过程中FOXO3a mRNA和蛋白的表达10μg/L TGF-β组FOXO3a mRN A随时间增加表达减弱,差别有统计学意义(P<0.05);阴性对照组差别无统计学意义(P>0.05)10μg/L TGF-β组FOXO3a蛋白随时间增加表达减弱,差别有统计学意义(P<0.05);阴性对照组差别无统计学意义(P>0.05)4.3增强FOXO3a表达对细胞EMT的影响。4.3.1 FOXO3a载体的构建与验证。4.3.1.1 FOXO3a CDS全长序列PCR扩增及鉴定经吉凯基因测序验证,获取的目的基因片段与Pubmed中人FOXO3a CDS基因序列相同。4.3.1.2单菌落PCR验证取单个菌落进行PCR电泳,电泳结果无误。4.3.1.3质粒测序结果取上述鉴定合格的GV230-FOXO3a质粒送吉凯基因测序,与NCBI进行对照,结果正确。4.3.1.4质粒转染荧光验证将重组质粒转染入16HBE细胞12h后,正常对照组未见绿色荧光,GV230-FOXO3a质粒组及转染阴性质粒组可观测到绿色荧光,证明质粒转染成功,并在细胞中表达蛋白。4.3.2检测增强FOXO3a表达后,EMT过程中α-SMA、E-cadherin mRN A和蛋白的表达变化。TGF-β+FOXO3a质粒组α-SMA mRNA和蛋白表达水平明显低于TGF-β+阴性质粒组及TGF-β诱导组,差别具有统计学意义(P<0.05);TGF-β组与TGF-β+阴性质粒组差别无统计学意义(P>0.05);正常对照组,FOXO3a组,阴性质粒组,差别无统计学意义(P>0.05)。TGF-β+FOXO3a质粒组E-cadherin mRN A和蛋白表达水平明显高于TGF-β+阴性质粒组及TGF-β诱导组,差别具有统计学意义(P<0.05);TGF-β组与TGF-β+阴性质粒组差别不具统计学意义(P>0.05);正常对照组,FOXO3a组,阴性质粒组,差别不具统计学意义(P>0.05)。5结论TGF-β诱导支气管上皮细胞可以成功在体外模拟EMT的过程,FOXO3a在TGF-β诱导的支气管上皮细胞上皮-间质转化中起到抑制的作用。