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酒精性肝损伤（Alcoholic liver disease,ALD）是酒精所致肝细胞功能受损的动态病理过程,随着病理变化过程的加重,酒精性肝损伤可逐渐形成酒精性脂肪肝、酒精性肝炎、酒精性肝硬化,甚至肝细胞癌等。目前,ALD发生发展过程的分子机制尚不完全清楚,也无明确的治疗靶点。近年来大量的临床数据和动物研究表明,酒精在肝脏中可同时诱导多种细胞死亡模式,且不同肝病的肝细胞死亡方式也有很大差异。铁死亡（Ferroptosis）是一种铁依赖、脂质过氧化介导的新型程序性细胞死亡,在Dixon于2012年正式命名之后迅速掀起研究热潮。长期以来,关于酒精导致肝细胞死亡模式的研究主要集中于凋亡和程序性坏死,因此,进一步研究酒精诱导肝细胞铁死亡的机制及其作用靶点对ALD的预防和缓解具有重要意义。生物节律是机体以24 h为周期的内在时间系统。生物钟有条不紊的调控着机体的生命活动,对维持机体代谢平衡,营养摄取及机体健康起着重要作用。扰乱人体生物节律会使正常代谢过程紊乱,对人体健康造成威胁。酒精已经被很多研究者在体内和体外两个层面证明可扰乱肝细胞生物节律,然而酒精诱导的生物节律紊乱是否在铁死亡中发挥作用仍未可知。褪黑素是一种由松果体分泌的能够调节昼夜节律的激素。研究表明褪黑素可以通过降低氧化应激或恢复昼夜节律和功能缓解肝脏疾病。目前已经有很多研究证明褪黑素可以缓解酒精诱导的肝损伤,但是缺乏较为深入的机制研究。本研究以HepG2细胞为体外研究模型,同时根据美国国家酒精滥用和酒精中毒研究所推荐的Gao-Binge方法构建酒精性肝损伤小鼠模型,探究酒精在体内和体外诱导肝细胞铁死亡的作用机制。同时,对褪黑素缓解酒精诱导肝细胞铁死亡的作用及其通过靶向调控核心生物节律蛋白BMAL1缓解铁死亡的分子机制进行探究。主要研究内容与结果如下:（1）探讨酒精对肝细胞铁稳态和氧化还原平衡的影响及其触发铁死亡的分子机制。对C57BL/6小鼠肝细胞和HepG2细胞铁死亡指标铁离子、MDA、GSH和ROS含量,GPX4和ACSL4蛋白的表达水平,线粒体膜电位变化和线粒体损伤情况进行检测,发现铁死亡指标均明显被酒精激活,说明酒精可诱导肝细胞铁死亡。随后对C57BL/6小鼠肝组织H＆E染色观察及血清ALT和AST水平进行测定,发现Fer-1可明显缓解酒精诱导的C57BL/6小鼠肝损伤,说明铁死亡参与了酒精诱导的肝损伤。最后对C57BL/6小鼠肝细胞和HepG2细胞铁死亡通路进行检测,发现酒精可以降低铁代谢蛋白FTH、FPN和抗氧化蛋白HO-1和SLC7A11的表达水平,而Fer-1可明显逆转这一情况,说明酒精通过破坏细胞氧化还原平衡状态和诱导铁代谢紊乱,从而触发铁死亡。（2）探讨生物节律蛋白BMAL1通过调控Nrf2-ARE通路改善酒精诱导的肝细胞铁死亡。首先对C57BL/6小鼠和HepG2细胞中节律蛋白BMAL1的表达进行检测,发现酒精可上调BMAL1蛋白的表达水平,而Fer-1可明显抑制这一情况,说明酒精激活的BMAL1上调与铁死亡有关。随后对HepG2细胞铁死亡指标铁离子、MDA、GSH和ROS含量,GPX4和ACSL4蛋白的表达水平及线粒体膜电位变化和线粒体损伤情况进行检测,发现利用小干扰RNA技术沉默BMAL1后,酒精诱导的铁死亡进一步加剧,说明BMAL1的激活在酒精诱导的铁死亡中发挥保护作用。进一步对BMAL1的保护作用机制进行研究,发现沉默BMAL1后,酒精诱导的Nrf2及其下游调控铁死亡的蛋白FTH、FPN、HO-1和SLC7A11蛋白表达下降的情况加剧。同时,沉默Nrf2加剧了酒精诱导铁死亡的程度,且FTH、FPN、HO-1和SLC7A11的表达也进一步下降,与沉默BMAL1的结果一致,说明BMAL1通过调控Nrf2-ARE通路在酒精诱导的肝细胞铁死亡发挥保护作用。（3）探讨褪黑素通过介导生物节律蛋白BMAL1缓解酒精诱导的肝细胞铁死亡的作用及分子机制。通过对C57BL/6小鼠肝细胞和HepG2细胞中铁死亡指标铁离子、MDA、GSH和ROS含量,GPX4和ACSL4蛋白的表达水平及线粒体膜电位变化和线粒体损伤情况进行检测,发现褪黑素干预处理可明显缓解降低铁死亡指标,说明褪黑素可以缓解酒精诱导的肝细胞铁死亡。接着以C57BL/6小鼠肝细胞和HepG2细胞中节律基因和蛋白BMAL1、Clock、Per1、Per2、Cry1和Cry2为研究对象,每隔6 h测定其节律振荡趋势,发现褪黑素干预可显著改善酒精引发的异常相位移动和振幅衰减的情况,说明褪黑素可以缓解酒精诱导的肝细胞生物节律失调。随后对HepG2细胞铁死亡指标铁离子、MDA、GSH和ROS含量,GPX4和ACSL4蛋白的表达水平及线粒体膜电位变化和线粒体损伤情况进行检测,发现利用si RNA技术沉默BMAL1后,褪黑素对酒精诱导的铁死亡的保护作用被抑制,说明BMAL1在褪黑素缓解酒精诱导的铁死亡中发挥重要作用。最后进一步研究BMAL1在褪黑素缓解酒精诱导铁死亡中发挥的保护作用机制,发现褪黑素可以明显上调Nrf2及其下游蛋白FTH、FPN、HO-1和SLC7A11的表达,而沉默BMAL1后,褪黑素对该通路的激活作用被抑制,说明褪黑素通过调节BMAL1介导的Nrf2-ARE通路缓解酒精诱导的肝细胞铁死亡。综上所述,本研究从体内和体外两个水平阐述了酒精破坏肝细胞氧化还原平衡、扰乱铁稳态进而触发铁死亡的分子机制及褪黑素缓解酒精诱导肝细胞铁死亡的作用机制,最终阐明褪黑素通过靶向调控生物节律蛋白BMAL1激活Nrf2-ARE抗铁死亡通路,恢复肝细胞氧化还原平衡和铁稳态,缓解铁死亡。