炎症性肠病(inflammatory bowel disease,IBD)是一种现阶段较常见的肠道慢性疾病,其主要的特征为炎症反应及组织损伤,基本上可以分为两大类,分别为克罗恩病(crohn’s disease,CD)和溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)。IBD的临床表现主要为腹泻、腹痛及血便等,对患者造成极大的痛苦,但是其具体发病机制尚不明确。白头翁是一味历史悠久的中药,由于其具有“凉血解毒”的功效,已经在肠阿米巴病、细菌感染、阴道滴虫病、疟疾和恶性肿瘤的辅助治疗中被广泛应用。Hederasaponin C(HSC)是白头翁的主要成分之一,含量高达1%。但是对于HSC的进一步药理活性研究较少,并且没有其对于IBD的治疗作用的相关报道。本研究通过建立体内UC及CD模型来系统性评估HSC抗IBD的疗效,并阐明其作用机制,为IBD的治疗提供新型候选药物分子。1.HSC对LPS诱导的炎症反应的抑制作用HSC抑制LPS诱导的RAW264.7细胞炎症因子表达:分别采用酶联免疫吸附实验和定量即时聚合酶链锁反应检测细胞炎症因子表达的差异。LPS刺激后,细胞内的白细胞介素-6和肿瘤坏死因子-α的信使RNA表达量和蛋白含量明显上升;HSC能够明显降低炎症因子的表达及释放,并且呈明显的量效关系。HSC抑制LPS诱导的RAW264.7细胞核转录因子κB的激活:分别采用免疫印迹试验和免疫荧光技术,研究HSC对核转录因子κB的影响。结果显示,在RAW264.7细胞中LPS诱导的p-IKKα/β表达被HSC所抑制,且呈现剂量依赖性,而IκBα的表达提高,从而抑制了核转录因子κB的核易位。HSC抑制LPS诱导的Toll-样受体4的二聚化:在HEK293T细胞中同时转染HA-TLR4和FLAG-TLR4,并且采用免疫共沉淀技术(IP)研究HSC对Toll-样受体4二聚体形成的影响。结果表明,HSC可以抑制LPS诱导的受体的二聚化。2.HSC对大鼠炎症性肠病的抑制作用在本研究中,我们首先建立了乙酸诱导的大鼠溃疡性结肠炎模型三硝基苯磺酸诱导的大鼠克罗恩病模型,对HSC治疗IBD的活性进行了初步评价。结果提示HSC(2.5、5 mg/kg,腹腔注射)或美沙拉秦(200 mg/kg,灌胃口服)能够抑制造模动物体重下降率,改善造模动物的疾病活动指数,降低肠质量系数,这一结果与造模组相比有显著统计学差异。结肠组织病理切片观察结果提示模型组大鼠肠道组织见溃疡形成,炎细胞浸润显著,其间形成较多新生小血管,血管充血扩张,部分区域见红细胞渗出,而HSC给药组及美沙拉秦组炎性细胞浸润减少,杯状细胞数量相对增多,黏膜肌层未见组织水肿和充血,组织形态已明显恢复,且HSC给药组的结肠恢复效果与美沙拉秦组相当。3.HSC的初步安全性评价HSC与家兔的红细胞悬液共孵育3小时,未见明显的溶血现象,表明HSC没有溶血活性。采用MTT法检测HSC对细胞生存率的影响,发现HSC对RAW264.7、HT-29、HEK293T细胞的增殖没有影响;取ICR小鼠,腹腔注射给药HSC(5 mg/kg),观察14天,HSC组小鼠的无行为异常及中毒现象的发生,体重与正常组比没有差异。综上所述,HSC能够通过抑制TLR4的二聚化,从而阻断TLR4/NF-κB的信号传导,起到下调炎症因子IL-6和TNF-α的表达及释放的作用。体内研究结果表明,HSC对于大鼠的结肠炎具有抑制效果,表现出显著的抗IBD活性。该研究为IBD新药物的创制提供了候选药物分子。