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第一部分经动脉内脑局部低温治疗的最佳灌注条件探索背景和目的—急性缺血性卒中（Acute ischaemic stroke,AIS）血管再通后脑组织发生缺血/再灌注损伤（Ischemia/reperfusion injury,IRI）是影响临床转归的重要因素。现有的神经保护药物均未实现很好的临床转化。治疗性低温（therapeutic hypothermia）是一种很有希望的神经保护措施,可以针对瀑布式级联病理生理过程的多个环节,全面抑制脑缺血再灌注损伤（cerebral ischemia-reperfusion injury,CIR）网络,包括降低细胞代谢、减少自由基生成、抑制钙离子超载和炎症反应以及减轻兴奋氨基酸毒性等。但全身性低温因副作用大,临床难以实施。近年来,随着血管内取栓治疗的广泛开展,经动脉内脑局部低温（Intra-arterial hypothermia,IAH）治疗AIS已成为可能。本部分在大鼠大脑中动脉血管阻塞（Middle cerebral artery occlusion,MCAO）模型中探索IAH减轻I/R的安全可行性及最佳干预条件。方法—建立成年雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠（体重240-265g）MCAO模型。大鼠大脑中动脉血管阻塞2小时撤出线栓后,立即经颈外动脉（Internal carotid artery,ECA）插入介入微导管至颈内动脉（Internal carotid artery,ICA）近入颅处,经同侧ICA灌注冷生理盐水行脑局部低温治疗。脑局部低温治疗依据三因素三水平的不同低温生理盐水灌注条件,包括灌注温度（4、10、15℃）,灌注速度(选择ICA血流速度的1/3、1/2、2/3,即1/3VICA、1/2VICA、2/3VICA)和持续灌注时间（10、20、30min）,使用正交实验设计分为H1-H9亚组。灌注过程中监测大鼠的生命体征、血液常规、生化指标以及低温治疗副作用和相关并发症,以评估模型动物的耐受性和IAH的安全可行性;监测灌注液温度（T0）、脑缺血组织（Tb）和颈静脉球部(Tjvb)温度,以及全身核心体温(Tcore),并分析各部位温度之间的关系。缺血再灌注24h后,通过动物行为学（大鼠改良神经功能缺损评分（modified Neurological Severity Score,mNSS））评估神经功能缺损程度,组织TTC染色检测脑梗死体积,计算脑组织含水量评估脑水肿程度。根据模型大鼠的耐受性、低温干预后神经功能缺损程度以及梗死体积和脑水肿情况确定脑局部低温治疗的最佳干预条件。结果—经颈内动脉灌注冷生理盐水过程中大鼠生命体征平稳,心率、脉搏、呼吸频率等指标均无显著变化。血氧饱和度降低0.5-5.4%,均仍在90%以上。灌注前后大鼠血液常规和生化等重要指标虽有不同程度变化,但均无明显异常。脑局部低温治疗副作用以及相关并发症发生率较低,其中寒战（0-14.8%）,多尿（3.7-25.9%）,肺水肿/感染（0-11.1%）,伤口延迟愈合（0-18.5%）。生存率为70.4-85.2%。各H亚组均能够在10分钟内将缺血侧Tb降至35℃以下的治疗性亚低温水平,并能够维持Tb在亚低温水平10-90分钟;而对全身核心体温影响小,Tcore降低均不超过1℃。灌注液温度越低,灌注速度越快,越能够快速将Tb降至治疗性亚低温水平。灌注结束后各部位温度缓慢平稳回升至灌注前水平,其中Tjvb下降幅度均小于Tb,两者之间存在显著相关性（Rho>0.98,P<0.01）。各H亚组mNSS分数、脑梗死体积和脑组织含水量进行正交实验设计方差分析结果显示,当灌注条件为使用4℃生理盐水以2/3VICA灌注速度持续灌注20min时,大脑中动脉血管阻塞/血管再通（Middle cerebral artery occlusion/revascularization,MCAO/R）模型大鼠神经功能缺损评分的mNSS分数最低,脑梗死体积最小,脑组织含水量最低,脑水肿程度最轻。结论—经动脉内灌注冷生理盐水治疗MCAO/R模型大鼠是安全可行的,副作用轻微,动物耐受性良好。可在较短时间内有效降低MCAO/R模型大鼠局部脑组织温度,而对全身核心体温影响很小。监测同侧颈静脉回流血温度有助于推测局部脑组织降温的情况,指导动脉内脑局部低温的实施。脑局部低温治疗MCAO/R模型大鼠的最佳干预条件为使用4℃生理盐水以2/3VICA灌注速度持续灌注20min,可快速降低脑局部组织温度至亚低温水平,明显改善MCAO/R模型大鼠神经功能缺损程度,减少脑梗死脑体积以及脑水肿程度,起到神经保护作用。第二部分动脉内脑局部低温减轻脑缺血再灌注损伤的神经保护作用目的—研究最佳灌注条件下,动脉内脑局部低温（IAH）对MCAO/R模型大鼠脑缺血再灌注损伤的神经保护作用,并观察其对脑神经血管单元（Neurovascular unit,NVU）微血管屏障的保护效果。方法—建立大鼠MCAO/R模型。实验分假手术组（sham组）,永久性脑缺血组（Permanent ischemia group,I组）,即大脑中动脉永久闭塞（Permanent middle cerebral artery occlusion,pMCAO）组,脑缺血再灌注组（Ischaemia/reperfusion group,I/R组）,即大脑中动脉闭塞后血管再通（Middle cerebral artery occlusion/recanalization,MCAO/R）组,以及脑缺血再灌注+脑局部低温治疗组（Intra-arterial hypothermia group,H组）。H组经颈动脉生理盐水灌注条件为4℃、2/3VICA、20min。缺血再灌注24h后mNSS评估神经功能缺损程度,TTC染色和磁共振影像检测脑梗死体积,计算脑组织含水量评估脑水肿程度;伊文思蓝（EB）示踪染色观察血脑屏障完整性;蛋白免疫印迹（Western blotting,WB）和免疫荧光染色（Immunofluorescence staining,IF）检测血脑屏障主要结构蛋白ZO-1、Occludin、Claudin5和AQP-4蛋白表达与分布情况,以及血脑屏障损害相关的关键蛋白基质金属蛋白酶（Matrix metalloproteinases,MMPs）和冷诱导RNA结合蛋白（cold-inducible RNA-binding protein,CIRP）的蛋白表达水平。结果—与I/R组比较,H组mNSS分数降低（P=0.007,n=20）,神经功能缺损程度有所改善;TTC染色和MRI影像显示脑梗死体积减小（p<0.0001,p<0.0001,n=7）;脑组织含水量减少（P<0.0001,n=7）,脑水肿程度减轻;脑组织EB含量降低（P<0.0001,n=7）,脑微血管屏障通透性增加;ZO-1、Occludin和Claudin5蛋白表达水平升高（p<0.01,p<0.01,p<0.01,n=7）,其中ZO-1蛋白分布较密集连续,结构更为完整（p<0.01,n=7）;而AQP-4蛋白表达水平降低（p=0.012,n=7）;MMP-2和MMP-9蛋白表达水平降低（p=0.025,p=0.015,n=7）,而CIRP蛋白表达水平进一步升高（p=0.02,n=7）。结论—动脉内脑局部低温治疗能够明显降低MCAO/R模型大鼠脑组织MMPs的表达,减轻神经血管单元微血管屏障相关结构蛋白的降解破坏,保护血脑屏障结构完整性;并减少脑梗死体积,减轻脑水肿程度,改善神经功能转归,起到神经保护作用。动脉内脑局部低温时脑组织CIRP表达升高,有可能在动脉内脑局部低温减轻脑缺血再灌注损伤的神经保护作用中发挥作用,其具体作用机制有待进一步探究。第三部分动脉内脑局部低温可能通过上调CIRP减轻神经血管单元缺血再灌注损伤目的—探究CIRP是否参与动脉内脑局部低温减轻MCAO/R模型大鼠缺血再灌注损伤的神经保护作用,尤其在调控基质金属蛋白酶、保护神经血管单元微血管屏障结构完整性中的分子机制。方法—使用大鼠脑立体定位仪向大鼠侧脑室注射CIRP敲除和过表达慢病毒（吉凯基因公司合成）构建雄性CIRP基因修饰（CIRP敲低和过表达）SD大鼠（100-120g）,2周后免疫印迹验证基因表达修饰情况。实验分阴性对照(CIRPNC)、CIRP基因敲低(CIRPsh)和过表达(CIRPover)组,每组又分假手术（S）、脑缺血再灌注（I/R）和脑局部低温治疗（H）亚组。H组大鼠血管再通后立即送入介入微导管经同侧ICA灌注冷生理盐水行脑局部低温治疗(4℃、2/3VICA、20min)。再灌注24h后通过免疫印迹等技术检测血脑屏障主要结构蛋白ZO-1、Occludin和AQP4以及MMPs的蛋白表达水平。结果—侧脑室慢病毒注射方法可成功构建基因敲除(CIRPsh)和过表达(CIRPover)SD大鼠（p<0.01,p<0.01,n=7）。I/R亚组中,相较于CIRPNC组中,CIRPover组mNSS分数低（p=0.016,n=9）,神经功能缺损有所改善;ZO-1和Occludin蛋白表达水平均有所升高（p=0.001,p=0.025,n=7）,结构蛋白破坏减轻,微血管屏障完整性保存较好,而AQP4的表达水平则有所降低（p=0.012,n=7）;MMP-2和MMP-9蛋白表达水平均显著下调（p=0.015,p=0.02,n=7）。而CIRPsh组mNSS分数升高（p=0.03,n=9）,神经功能缺损有所加重;ZO-1和Occludin蛋白表达水平均有所降低（p=0.007,p=0.015,n=7）,结构蛋白破坏加重,微血管结构完整性受损加重,而AQP4的表达水平则有所升高（p=0.042,n=7）,MMP-2和MMP-9蛋白表达水平均显著上调（p=0.004,p=0.019,n=7）。CIRPNC和CIRPsh组中,较I/R亚组,各H亚组mNSS分数均较低（p=0.033,p=0.022,p=0.018,n=9）,神经功能受损程度减轻;ZO-1（p=0.004,p=0.005,n=7）和Occludin蛋白（p=0.006,p=0.034,n=7）表达水平均升高,结构蛋白破坏减轻,微血管屏障结构保存较完好,而AQP4的表达水平则降低（p=0.015,p=0.011,n=7）;CIRP蛋白的表达水平均进一步升高（p=0.001,p<0.001,n=7）,而MMP-2（p=0.022,p=0.002,n=7）和MMP-9（p=0.044,p=0.018,n=7）蛋白表达水平均有所降低。结论—动脉内脑局部低温可能通过上调CIRP,降低基质金属蛋白酶（MMPs）的表达,减轻血脑屏障结构蛋白的降解破坏,保护血脑屏障结构完整性,并改善神经功能转归,发挥神经保护作用。CIRP可能是低温发挥脑保护作用的一个重要环节,有望成为缺血性卒中脑保护的潜在治疗靶点。