1．背景与目的鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma，NPC)是东南亚及中国南方各省常见的一种恶性肿瘤，发病率15～50／10万，其发病极具地域性和人群特色，中国广东省的发病率居世界首位，死亡率平均约为十万分之七，严重危害着人民的生命健康。放射治疗是鼻咽癌的首要治疗手段，放疗后5年生存率达60％左右。但仍有8～13％的病例放疗后局部残留，20～30％的病例局部复发；其中照射野内残留或复发约占50％，提示部分鼻咽癌放射抗拒。人们对肿瘤放射抵抗的机制尚缺乏全面和深入的认识。肿瘤微环境的炎症、血供不足以及乏氧细胞、DNA损伤修复能力增强和某些癌相关基因等因素被认为和放射抵抗有关。同放射抵抗相比，人们目前对肿瘤多药抗性(multidrug resistance，MDR)的发生机制已有较深刻的认识，其中多药耐药基因(MDR1)基因扩增及其编码产物P糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)的过度表达是目前已发现的最重要的一种多药耐药机制，大多数肿瘤MDR的发生被认为与P-gp有关。P-gp是由MDR1基因编码、由1280个氨基酸残基组成、分子量为170KD的跨膜蛋白，具有能量依赖性的外流泵功能，在ATP供能的条件下，将细胞内化疗药物或毒素等物质逆着浓度差转运到细胞外，从而减少多种不同化学结构和作用机制的药物或毒素在细胞内的蓄积，结果细胞对细胞毒药物的敏感性降低，产生细胞的耐药性。肿瘤细胞一旦产生耐药性，就不单是仅针对某一细胞毒药物，对其他细胞毒药物也同时产生了耐药性，表现为肿瘤的多药抗性。现已证实人MDR1基因位于第7号染色体7q21，含28个外显子，cDNA全长为4.5Kb，仅有一个开放阅读框。在不同的细胞系中MDR1启动子显示的活性不同，其增强子的活性亦不同，因此MDR1表达具有异质性和组织特异性。P-gp可能具有潜在的多重生理效应，直接或间接地参与细胞的分子代谢、增殖、分化、凋亡等方面的调控。P-gp不仅引起肿瘤耐药，还可延迟凋亡级联反应，保护耐药细胞免于细胞毒性药物诱导的多种形式的caspase依赖性凋亡；P-gp通过稳定肿瘤细胞线粒体膜电位和线粒体膜通透性，抑制X射线的凋亡效应，从而递呈放射抵抗表型，阻断P-gp表达可有效逆转放射抵抗。基因的多态性可能对基因的表达或功能产生重要影响。迄今已报道MDR1基因在27个位点上有28个单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)，其中研究较多的21外显子G2677T(Ala893Ser)和26外显子C3435T(Ile1145Ile)及其单体型，与P-gp的功能和表达密切相关。MDR1基因的多态性可能与鼻咽癌的放射敏感性相关以影响放疗对鼻咽癌局部控制的疗效。本研究旨在通过调查MDR1基因的单核苷酸多态性在鼻咽癌放射敏感和放射抵抗患者中的分布以及上述多态性对MDR1 mRNA在分具不同放射敏感性的三株细胞系内的差异表达的影响，探讨MDR1基因多态性与鼻咽癌放射敏感性的相关性。2．方法采用病例—对照的研究方法。(1)以小样本为研究对象，选取鼻咽癌放射抵抗和放射敏感各5个病例，针对NCBI Genebank中MDR1所有外显子和启动子核心调控区域设计引物进行PCR扩增，产物在ABI 3730测序仪上测序，序列读解采用Chromas软件，并结合NCBI SNP数据库和文献资料寻找和验证SNP位点，筛选出合适的SNP用于下一步实验。(2)以18例鼻咽癌放射抵抗病例及30例鼻咽癌放射敏感病例为研究对象，针对已筛选出的SNP进行批量PCR扩增及测序分型，序列结果采用Chromas软件读解；针对所筛选的SNP位点在放射抵抗组和放射敏感组基因型或等位基因分布差异做χ~2检验，计算其P值和OR值；将每个SNP位点的基因型分布数据分别做Hardy-Weiberg equilibrium检验，使用基于贝叶斯算法的PHASE软件构建单体型，并对所构建单体型在两组中的分布差异做χ~2检验，计算其P值和OR值；上述统计学处理均使用SPSS13.0统计软件完成，双侧检验，显著性标准为P＜0.05。(3)利用同样的方法对CNE1、CNE2、HNE1、HONE1、5-8F、6-10B六株鼻咽癌细胞系做MDR1基因测序，根据其在所筛选SNP位点基因型分布，并结合上述细胞系的放射生物学行为特点，选择CNE1、HNE1、5-8F，利用实时荧光定量PCR(realtime fluorescent quantitiative PCR)测定MDR1 mRNA在上述三株细胞系的表达情况，分析其表达差异。3．结果3．1 MDR1基因第21号外显子G2677T基因型在抵抗组与敏感组的分布均表现出显著性差异(P=0.009)：以GG基因型为参照，暴露于T等位基因型(GT+TT基因型)的OR值为5.333(95％CI∶1.033～27.534，P=0.033)，GT、TT基因型各自的OR值为3.375(P=0.283)和21.000(P∶0.009)；以GG+GT基因型为参照，TT基因型的OR值为8.909(95％CI∶1.596～49.717，P=0.017)。可见随等位基因T的出现鼻咽癌发生放射抗拒的风险将增加，尤其是TT纯合子基因型出现时，这种风险将显著增加；趋势检验：χ~2=8.784，P=0.003。以G等位基因为参照，暴露于T等位基因的OR值为3.538(95％CI∶1.488～8.416，P=0.004)。3．2 MDR1基因第26号外显子C3435T基因型和等位基因在抵抗组与敏感组的分布差异均具有统计学意义(P≤0.017)：以CC基因型为参照，暴露于T等位基因型(CT+TT基因型)的OR值为4.632(95％CI∶0.892～24.042，P=0.111)，CT、TT基因型各自的OR值为3.361(P=0.271)和27.500(P=0.010)。以CC+CT基因型为参照，TT基因型的OR值为11.154(95％CI∶1.182～105.243，P=0.022)。可见随等位基因T的出现鼻咽癌发生放射抗拒的风险将增加；尤其是TT纯合子基因型出现时，这种风险将显著增加。趋势检验：χ~2=7.352，P=0.007。以C等位基因为参照，暴露于T等位基因的OR值为2.800(95％CI∶1.194～6.569，P=0.017)。3．3 MDR1基因第12号外显子C123 6T基因型和等位基因在抵抗组与敏感组的分布差异均不具有统计学意义(P≥0.100)，尽管抵抗组T等位基因或TT基因型出现频率高于敏感组，而C等位基因或CC基因型频率低于敏感组。3．4 MDR1基因T-129C(exon 1b)、C1149T(exon 11)基因型和等位基因在抵抗组与敏感组的分布均无显著性差异(P≥0.1 36)，尽管杂合子仅在抵抗组出现。G1400A基因型和等位基因在抵抗组与敏感组的分布亦无显著性差异(P≥0.142)。3．5上述所筛选的MDR1基因SNP在两组的基因型分布均符合Hardy-Weiberg equilibrium(P≥0.188)。基于上述基因型分布，构建三个block：C1236T-G2677T、G2677T-C3435T和C1236T-G2677T-C3435T。分别比较上述block在两组的分布发现：C1236T-G2677T单体型在两组的分布无显著性差异(P=0.056)，但携带有1236T-2677T单体型的病人发生放射抗拒的可能性显著高于其它单体型(P=0.033)；G2677T-C3435T单体型在两组的分布有显著性差异(P=0.029)，携带有2677T-3435T单体型的病人发生放射抗拒的可能性显著高于其它单体型(P=0.013)；C1236T-G2677T-C3435T单体型在两组的分布无显著性差异(P=0.128)。3.6鼻咽癌细胞系CNE1、HNE1、5-8F分别具有不同的放射敏感性，HNE1和5-8F放射敏感性高于CNE1；经DNA测序发现它们在MDR1 C1236T、G2677T、C3435T三个SNP位点的基因型也有差异，CNE1的基因型分别为：C1236T为CT型，G2677T为GT型，C3435T为CT型；HNE1的基因型为：在C1236T为CT型，G2677T为GT型，C3435T为CC型；5-8F的基因型为：C1236T为CT型，G2677T为GG型，C3435T为CC型。抽提上述三株细胞系的总RNA，并做realtime RT-PCR，测定MDR1 mRNA在这三株细胞系中的表达水平并分析：MDR1 mRNA在CNE1细胞系的表达量分别是其在HNE1和5-8F细胞系表达量的2.34和2.42倍。这一结果提示上述三株细胞系的放射敏感性差异可能与MDR1 mRNA在它们中的表达差异相关，而它们MDR1的基因多态性可能影响mRNA的表达；MDR1上述SNP位点的突变等位基因可能提示MDR1 mRNA表达上调而使鼻咽癌细胞发生放射抗拒的风险增加。4．结论G2677T、C3435T等MDR1基因单核苷酸多态性与鼻咽癌放射敏感性显著相关(P≤0.017)，2677TT、3435TT、1236T-2677T、2677T-3435T基因型或单体型携带者鼻咽癌发生放射抗拒的风险显著增加(P≤0.033)；鼻咽癌细胞系MDR1 mRNA表达与细胞系放射敏感性相关，鼻咽癌细胞系G2677T、C3435T等基因多态性可能影响其MDR1 mRNA的表达。总之，MDR1基因多态性可作为遗传学标志预测鼻咽癌细胞放射敏感性的差异，MDR1基因型多态性可能影响其mRNA在细胞系内的表达。上述结论还需继续扩大标本加以验证，阐明上述基因多态性的生物学意义以期进一步明确MDR1基因多态性对鼻咽癌放射抵抗表型递呈的作用机制。