巨噬细胞是机体免疫系统重要的组成部分,能够吞噬和杀灭细菌、寄生虫、肿瘤细胞以及自身衰老和死亡的细胞等,并能发挥机体的免疫防御、免疫自稳、免疫监视等功能。巨噬细胞广泛分布于全身各个组织,由单核细胞分化而来,成熟的单核细胞通过血管内皮迁移至不同组织中,分化成组织特异性的巨噬细胞。如肝、脾、肺、神经中枢组织、骨及结缔组织中,组织特异性的巨噬细胞均会通过不同的途径行使功能。以肺泡巨噬细胞为例,当致病物入侵时,肺泡巨噬细胞表面的模式识别受体(PRR)——Toll样受体(Toll-like-receptor)会与相应配体的结合进而上调巨噬细胞的吞噬能力。模式识别受体(PRR)对于巨噬细胞发挥吞噬功能尤为重要,其主要通过识别致病物的特异性区域,进而将致病物吞噬消化。巨噬细胞表面的模式识别受体主要有三类,第一类的主要功能是作为激活补体,如mac1;第二类受体能够结合并吞噬抗原,如toll-like受体;第三类受体具有信号分子性质,它们被激活后能够影响基因转录活性。巨噬细胞的吞噬功能对于其发挥免疫防御作用十分关键。根据目前的研究显示,巨噬细胞的吞噬功能与多种疾病的发生密切相关。比如神经退行性疾病,目前认为小胶质细胞在神经退行性疾病的发病机制具有十分关键的作用。小胶质细胞能清除中枢神经系统中受损的神经、凋亡的细胞以及斑块等物质,若清除功能异常,则会导致疾病的发生。但有关巨噬细胞吞噬功能的关键调控分子及机制目前仍不明确,我们实验室始终关注巨噬细胞的研究,计划在全基因组水平进行一项有关调控细胞吞噬功能的关键基因的筛选工作,为后续的机制研究提供线索和思路。2013年CRISPR技术的出现为筛选工作带来了极大的便利。CRISPR/Cas9技术是近年兴起的革命性的新型基因组编辑技术,该技术可在细胞水平实现高效的基因编辑。CRISPR/Cas9技术的多功能及可编程特点,令其可以更快的构建小鼠的疾病模型,同时在遗传性疾病、恶性肿瘤等许多疾病的研究、治疗及预防方面均显示出巨大的应用潜力。随着CRISPR/Cas9基因编辑技术的不断优化,目前此项技术已在科研、医学等多个领域上被广泛应用。为了便于科研人员进行科学研究,处于该技术前沿领域的研究小组通过Addgene公司向研究人员提供了多种CRISPR/Cas9体系及全基因组文库。因此我们拟基于CRISPR全基因组文库进行巨噬细胞吞噬调控关键基因的筛选。进行筛选实验需要具备最基本的两个条件:1.涵盖足够基因的文库;2.易于操作和分析的筛选体系。根据实验需求,我们选取了由Zhang Feng实验室提供的小鼠CRISPR全基因组文库,此文库涵盖了20611个小鼠基因,同时设计了1000条无关序列的sgRNA。筛选实验的另一项关键因素是筛选体系的建立。我们设计筛选体系的原则是筛选结果便于观察及验证。根据文献调研,我们选用Clodronate-Liposomes作为筛选试剂,建立了巨噬细胞吞噬功能调控关键基因的筛选体系。clodronate-liposomes是利用脂质体将clodronate包裹在内,被具有吞噬能力的细胞吞噬后,在胞内溶酶体作用下,将脂质体降解并释放出clodronate,使其在细胞内累积,并生成具有毒性作用的atp类似物。理论上只有具备吞噬能力的细胞才能吞噬clodronate-liposomes,并且当clodronate在巨噬细胞内累积至一定的浓度时,细胞便会死亡。但如果调控吞噬的基因缺失,细胞失去吞噬能力,不再吞噬clodronate-liposomes,那么细胞便会存活。因此我们可以利用clodronate-liposomes,通过存活的细胞,筛选出吞噬功能缺失的细胞,并进一步通过细胞基因组的深度测序鉴定调控吞噬功能的关键基因。根据以上原理,我们首先建立了细胞筛选体系。1.确定clodronate-liposomes是否特异性的只对具有吞噬能力的的细胞致死以及clodronate-liposomes对ibmm细胞的最低致死剂量。为验证clodronate-liposomes是否特异性的只对具有吞噬能力的的细胞致死,我们设计实验如下:将clodronate-liposomes分别加入到具有吞噬能力的ibmm细胞、不具有吞噬能力的hela细胞、l929细胞以及hek293细胞中,发现只有ibmm细胞出现死亡的现象,其余细胞生长状态均无影响;通过设置浓度梯度实验,利用台盼蓝染色法观察细胞的存活情况,确定筛选实验中使用的clodronate-liposomes最低致死剂量为700μm。2.crispr全基因组文库病毒成功转染至细胞后,细胞便具有puro抗性,因此需要确定puro对细胞的最低有效剂量。通过设置浓度梯度实验,确定筛选实验中使用的puro最低有效剂量为1.5μg/ml。筛选实验的另一项关键要素是扩增出完整的基因组文库。根据文献调研,为保证文库扩增的完整性,此文库对感受态的转化率要求到达109cfu/μg,因此我们引进了超级感受态,此感受态菌的转化效率高达2×1010cfu/μg。我们利用电转超级感受态的方法,将crispr小鼠全基因组文库进行转化,根据转化实验中检测板的克隆数计算,我们扩增的总克隆数大约为3×107,超过了完整扩增文库的标准3×106,为后续实验做好了准备。文库扩增后,在hek293细胞中进行crispr文库病毒的包装。为保证每一个细胞只敲除一个基因,根据文献调研,当moi接近0.3时,满足上述要求,因此我们需要确定病毒的滴度。我们利用pi染色法检测crispr文库病毒滴度,选择moi接近0.3时的病毒体积进行ibmm细胞感染。成功感染ibmm细胞后,用含有puro的dmem完全培养基培养细胞2周后,存活的细胞即为文库细胞。将文库细胞部分留存,部分细胞使含有clodronate-liposomes的培养基培养,同时设置一组野生型细胞作为对照组,连续加clodronate-liposomes培养2天后,使用正常的完全培养基培养细胞7天,然后将存活的细胞收集,此时存活细胞即为筛选细胞。为进一步证明筛选实验体系的可靠性,取部分筛选细胞和文库细胞,分别用bioparticle和gfp-e.coli进行细胞吞噬能力的验证,结果显示筛选组细胞的吞噬能力明显下降。取部分筛选细胞和文库细胞提取基因组,进行深度测序。根据基因的富集度和软件评分情况,我们将测序结果进行了整理分析,发现排位前100个基因中,部分已知影响巨噬细胞吞噬能力的基因位列其中,比如:NFκB1、Serpinb9d、CD63、Fgfr2,同时测序结果中存在很多功能未知基因,这部分基因将是我们下一步重点研究的对象。综上,巨噬细胞发挥其免疫功能时,其吞噬功能是不可或缺的。本项研究成功应用Clodronate-Liposomes作为筛选试剂,以CRISPR小鼠全基因文库为基础,创新性地建立了巨噬细胞调控吞噬功能基因的筛选体系。此筛选方法基本涵盖了小鼠的全基因组,筛选结果便于观察及验证,即存活下来的细胞可能是调控吞噬基因缺失的细胞。并且通过深度测序,我们初步得到了可能影响吞噬功能的基因,为进一步探索巨噬细胞吞噬调控的机制奠定了基础,并为吞噬功能异常所致疾病的治疗提供了新的思路和科学依据。