第一部分从肠道黏膜屏障与内分泌-免疫系统探究小檗碱改善2型糖尿病大鼠糖脂代谢紊乱的机制目的低、中、高剂量的小檗碱干预2型糖尿病大鼠,从肠黏膜屏障、免疫系统及胃肠源性激素等探究小檗碱发挥降糖调脂作用的肠道局部机制。方法采用高糖高脂饮食联合尾静脉注射小剂量链脲佐菌素(STZ)的方法,建立雄性Wistar大鼠2型糖尿病模型,并随机分为模型组、小檗碱低中高剂量组及二甲双胍组,另设普通饮食的正常对照组。药物干预9周后,比较各组大鼠血糖、血脂、空腹胰岛素、肠道通透性等差异。HE染色观察各组大鼠回肠黏膜形态的改变;透射电镜观察小檗碱对大鼠回肠组织中肠上皮细胞间连接的影响。流式细胞技术检测不同组大鼠肠系膜淋巴结中T细胞、NK细胞、树突状细胞及巨噬细胞比例变化;ELISA检测糖尿病大鼠血浆中GLP-1、GIP、Ghrelin(生长激素释放肽)、Amylin(胰淀素)等胃肠源性激素的变化;RT-PCR技术检测各组大鼠肠组织中IL-6、TNFα、MIP、IL-10、TGF-β等细胞因子表达;Western Blot检测检测肠组织中Occludin、ZO-1、Claudin-1、TLR4、My D88、IKKβ磷酸化蛋白或总蛋白水平;回肠灌注葡聚糖观察小檗碱对大鼠肠组织的通透性的影响;免疫荧光法检测NFκB在肠上皮细胞胞浆与胞核的分布情况。结果小檗碱呈剂量依赖性降低糖尿病大鼠OGTT各时间点血糖浓度和血浆甘油三酯水平。肠道通透性研究中,透射电镜下可见小檗碱抑制糖尿病大鼠肠道上皮细胞间连接的损伤。回肠腔10cm环灌注FITC标记的葡聚糖(FITC-dextran)后,可见模型组大鼠大分子物质的通透性增加,而各浓度小檗碱组及二甲双胍组均可抑制肠道通透性增加,且小檗碱保护肠黏膜完整性与肠道紧密连接蛋白Occludin及ZO-1表达调控有关。肠系膜淋巴结流式细胞计数表明,糖尿病鼠巨噬细胞比例增加、Tregs细胞比例降低,小檗碱及二甲双胍均可降低肠道免疫系统中巨噬细胞、增加Treg细胞比例,而CD3+门中CD4+、CD8+T细胞比例以及OX62标记的树突状细胞未见明显的变化。肠黏膜免疫因子表达水平检测中,模型组大鼠促炎因子IL-1β、TNF-α、巨噬细胞迁移阻断因子(MIF)转录增加;具有肠黏膜屏障保护作用的IL-4、IL-10转录减少;小檗碱干预后,可抑制IL-1β、MIF转录;高剂量组小檗碱可降低TNF-α,增加IL-10、IL-4转录。ELISA结果显示,糖尿病大鼠血浆中,GLP-1及GIP表达下调,Amylin表达上调;小檗碱,尤其是高剂量组,可逆转上述变化。糖尿病大鼠肠组织中,TLR4、My D88、p-IKKβ蛋白表达增加,LBP、CD14转录增加;而小檗碱可抑制TLR4、My D88、p-IKKβ蛋白表达以及LBP、CD14的转录。结论小檗碱以剂量依赖性改善糖尿病大鼠的糖脂代谢紊乱,且作用靶点位于肠道。小檗碱改善糖尿病大鼠肠道免疫系统、肠黏膜屏障、胃肠源性激素的作用与调控TLR4/My D88/p-IKKβ/NFκB信号通路相关。第二部分从TLR4/My D88/NFκB信号转导通路探讨小檗碱改善巨噬细胞M1极化的机制目的小檗碱干预Raw264.7巨噬细胞及小鼠原代腹腔巨噬细胞,观察其对脂多糖(LPS)诱导的巨噬细胞炎性极化的影响并探讨作用机制。方法MTT实验确定小檗碱及二甲双胍等的干预浓度。不同浓度的LPS干预Raw264.7细胞3、6、12、24h,建立巨噬细胞炎性极化模型。电子显微镜观察极化过程细胞形态的改变;ELISA实验检测小檗碱等干预后对巨噬细胞炎症因子TNFα分泌的影响。RT-PCR检测M1型巨噬细胞IL-6、i NOS2、IL-1β、MIP等炎症因子表达;RT-PCR测定炎症极化相关TLR1、TLR2、TLR4、TLR5、TLR6、TNFR等信号蛋白的m RNA水平。Western Blot检测TLR4、p-AMPK等蛋白表达。共聚焦显微镜观察各组细胞NFκB的胞浆胞核分布。Co-IP法检测小檗碱对TLR4与My D88相互结合的作用,分子对接检测BBR与TLR4的结合亲和力。雌性昆明小鼠中,提取原代腹腔巨噬细胞,流式细胞仪鉴定F4/80+腹腔巨噬细胞比例。LPS干预后,观察小檗碱对腹腔巨噬细胞形态改变的影响,ELISA实验检测小檗碱对腹腔巨噬细胞分泌TNFα的影响,流式细胞计数观测小檗碱对F4/80+C D11c+M1巨噬细胞比例的影响。结果LPS干预后,原代腹腔巨噬细胞及Raw264.7巨噬细胞炎症因子TNFα分泌增加,IL-6、IL1β、MIP、i NOS2等炎性蛋白转录增加,细胞形态改变,逐渐伸出突起。小檗碱在不同时间点可部分抑制TNFα分泌,并抑制LPS诱导的炎症标志物的转录。LPS诱导后,F4/80+CD11c+M1极化的巨噬细胞比例增加,小檗碱预处理可抑制M1巨噬细胞比例增加。LPS干预3h,NFκB入核显著增加,小檗碱干预降低NFκB入核水平。Western Blot结果表明LPS干预3h时,TLR4、p-AMPK表达并未发生显著改变。Co IP检测TLR4与My D88的相互结合结果表明,LPS干预3h时,TLR4与My D88结合增加,且BBR可抑制TLR4与My D88的结合。BBR与TLR4分子对接发现,BBR可与TLR4四条链中A链、B链及C链多个位点结合,其中与A链结合位点亲和力最高。结论LPS刺激Raw264.7细胞3h即可发生炎性改变,小檗碱预处理可抑制Raw264.7巨噬细胞及原代腹腔巨噬细胞炎症极化。LPS干预6h后,TLR4及p-AMPK表达发生改变,而BBR在早时相抑制炎症反应与干扰TLR4/My D88/NFκB的信号转导相关。第三部分小檗碱对棕榈酸诱导巨噬细胞炎症的作用初探目的棕榈酸干预Raw264.7细胞,观察小檗碱对棕榈酸诱导巨噬细胞炎症的作用。方法比较含或不含BSA的棕榈酸对巨噬细胞的影响,MTT实验及ELISA法确定棕榈酸干预浓度。以棕榈酸干预Raw264.7细胞,ELISA法检测小檗碱或联合棕榈酸干预3h、6h、24h后细胞上清TNFα分泌情况。RT-PCR检测小檗碱对棕榈酸诱导的Raw264.7细胞IL-6、MIP-1、i NOS2表达的影响。甘油三酯试剂盒测定棕榈酸干预不同时间后细胞内甘油三酯的累积。游离脂肪酸试剂盒检测棕榈酸干预6h及24h后,细胞内及上清中游离脂肪酸的浓度,观察Raw264.7细胞对棕榈酸的摄取及脂质存储。结果BSA干预Raw264.7细胞可诱导炎症反应,遂以不含BSA的棕榈酸造模。小檗碱可抑制棕榈酸诱导的炎症反应。棕榈酸干预6h与24h后,细胞内甘油三酯含量无显著差异,但6h时细胞内游离脂肪酸水平有差异。结论小檗碱可抑制棕榈酸诱导的巨噬细胞炎症反应。但棕榈酸诱导6h内,Raw264.7细胞发生炎症的机制与甘油三酯在细胞内的累积无关,小檗碱改善棕榈酸诱导的巨噬细胞炎症机制需要深入探讨。