随着化石能源的过度消耗,寻找可再生能源显得日益重要。利用微生物转化生物质生产生物柴油是解决能源短缺的途径之一。微生物油脂是利用酵母菌、藻类、霉菌等微生物在一定生长条件下通过代谢在体内积累所产生的一种特殊油脂,其主要成分为甘油三酯(TAG),在组成上与植物油如棕榈油、菜籽油相似,以C16和C18为主。利用微生物生产油脂有以下优点:微生物生产油脂周期短、不受季节和气候的影响、营养简单、易于进行工业化大规模培养等。但目前微生物油脂的产量还不高,高产菌株的选育成为微生物油脂产业化的瓶颈。为了提高微生物油脂的积累能力、调控发酵过程中的相关工艺、挖掘油脂合成途径中的关键酶。本研究首先建立了气相色谱法对皮状丝孢酵母所生产的油脂进行脂肪酸成分检测的方法,可快速准确度地分析其成分。然后以皮状丝孢酵母(Trichosporon cutaneum)为出发菌株,利用常压室温等离子诱变仪(ARTP)对皮状丝孢酵母进行诱变并结合芝麻酚抗性筛选从突变库中成功筛选出一株油脂高产菌株。并利用响应面法和发酵罐对发酵培养基和发酵工艺进行优化。最后对高产油脂菌株进行了转录组分析,与原始菌株相比挖掘出两个与油脂合成相关的基因。相应的实验结果如下:(一)气相色谱法检测脂肪酸成分:对生产的油脂进行快速甲酯化,然后通过气相色谱进行成分检测。建立了气相色谱同时测定油脂酵母中棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、二十碳烯酸5种脂肪酸的检测方法。采用DB-FFAP毛细管柱(30 m x0.25 mm x0.25μm),在14 min内实现了5种脂肪酸甲酯的良好分离。各组分在156～2000mg/L的浓度范围内均呈现良好的线性关系,线性范围均>0.99,回收率在92%～96%之间,相对偏差均小于2%,可以满足酵母油脂的脂肪酸成分检测。(二)皮状丝孢酵母常压室温等离子体诱变选育:研究了常压室温等离子体(ARTP)诱变时间对皮状丝孢酵母(Trichosporon cutaneum)致死率的影响,考察了不同浓度梯度芝麻酚对皮状丝孢酵母生长的抑制程度,建立了一种快速高效选育高产油脂菌株的方法。实验表明:经过ARTP的40s诱变后,接种到0.15 mg/m L浓度的芝麻酚培养基中28℃培养2天,筛选出生长旺盛的菌株,然后接种到48孔液体培养基培养,并利用96孔板尼罗红荧光染色对培养菌种进行高通量筛选,选育出一株高产油脂菌株Trichosporon cutaneum A1。该菌株较原始菌株的生物量、油脂产量、油脂产率分别提高了41.6%、120.3%、58.3%。(三)响应面法优化发酵培养基组成:以皮状丝孢酵母(Trichosporon cutaneum)为出发菌株,对其产油脂的发酵培养基进行研究。以油脂产量为指标,通过单因素实验研究发酵培养基中的碳源、氮源、外源因子对油脂产量的影响,然后利用响应面实验对培养基进行优化。结果表明:最佳培养基配方为葡萄糖97.6 g/L、玉米浆干粉4.4 g/L、乙酸钠0.09 g/L,在该条件下,皮状丝孢酵母的油脂产量达到了14.4 g/L,比优化前提高114.9%。(四)发酵罐放大培养:对皮状丝孢酵母产油脂在发酵罐上的条件和工艺进行了研究,主要针对初始发酵葡萄糖浓度,初始玉米浆干粉浓度,转速进行了研究。研究结果表明,在发酵罐上更适合菌体生长和油脂积累,对葡萄糖的利用量从90g/L增大到120g/L,同时需要更多的氮源来进行蛋白质合成和生长发育,因此玉米浆干粉的添加量从4.5g/L增加到7.5g/L,在此条件下,菌体的生长得到大幅提高。同时,发现转速对溶氧的影响明显,低转速下,溶氧长时间处于零水平,不利于菌体的生长繁殖。较高转速下,溶氧充足,菌体生长状况良好,油脂产量高,而且发酵时长变短,更有利于生产。在最优条件下,菌体生物量达到41.5g/L,油脂产量达到25g/L,在110h内完成发酵。对发酵动力学进行研究,得到生物量、产物、底物的拟合曲线。(五)转录组测序及关键酶的基因分析:为了进一步研究高产菌株A1的基因表达和代谢通路的变化,利用转录组测序手段,对原始菌株WT和高产菌株A1进行发酵培养至油脂积累最大值时,然后进行转录组测序分析。结果表明,A1与WT相比,有1185个显著基因差异表达,其中767个基因表达上调,418个基因表达下调。在差异基因GO富集的分类中,细胞过程、代谢过程、催化活性、细胞部分等相关基因表现出富集。在KEEG代谢途径中,差异基因主要涉及酵母细胞周期、基因复制、戊糖和葡萄糖醛酸的相互转化、糖酵解/糖异生等过程。研究发现3个与脂肪酸积累相关的酶过表达,包括柠檬酸合成酶、甘油磷酸二酯磷酸二酯酶、3-磷酸甘油醛脱氢酶。这些结果可为后期的油脂酵母基因改造和代谢通路调控提供理论依据。