火龙果(Hylocereus undatus Britton & Rose)是仙人掌科多年生攀援性肉茎植物,其果实营养丰富,含有一般植物少有的花青苷和植物白蛋白,以及丰富的维生素和水溶性膳食纤维,具有很高的营养、经济、社会和生态价值。温度是影响火龙果发展的主要限制因素,有研究表明,火龙果抗寒力较差,温度低于5℃C时火龙果即可能受冻,而0℃是大多数栽培品种能忍受的最小阈值。贵州等南亚热带地区经常遭遇极端天气(低温冷害、倒春寒等)的影响,栽培火龙果容易发生严重冷害和冻害。本研究通过开展火龙果对低温胁迫的生理响应等相关研究,并通过生物技术手段离体诱变筛选抗寒突变体,旨在为火龙果的抗寒生理机制、抗寒新品种选育及寻找提高抗寒性的新途径提供重要的理论依据和技术方案。其主要研究结果如下：(1)以野生火龙果量天尺(Hylocereus undatus Liangtianchi)和贵州主栽火龙果品种紫红龙、晶红龙、粉红龙成年植株的1年生枝条为试材,测定不同温度(6、4、2、0、-2、-4和-6℃C)处理12h后枝条的电解质渗出率(REC),应用Logistic方程计算出半致死温度(LTso),并通过恢复生长试验进行验证；在LTso下设置不同处理时间,测定可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸(Pro)和丙二醛(MDA)含量,并进行抗寒性分析。结果表明：火龙果枝条的REC和细胞膜伤害率(MIP)均随温度降低呈“S”型上升,不同火龙果品种的LTso在0.347～-1.031℃之间；在LTso处理下,随着处理时间的延长,枝条中的可溶性糖、可溶性蛋白及MDA含量均呈逐渐增加的趋势,而Pro则呈先上升后下降的趋势。基于LTso及抗寒性相关生理指标分析,初步判断火龙果抗寒力大小表现为量天尺>晶红龙>粉红龙>紫红龙,这与枝条的恢复生长试验结果及大田表现基本一致。(2)以野生火龙果量天尺和贵州主栽火龙果品种紫红龙、晶红龙、粉红龙的1年生扦插幼苗为试材,人工控温进行抗寒锻炼、低温冷害处理及恢复生长,以未经任何处理作对照,测定不同处理下幼苗的REC、可溶性糖、可溶性蛋白、Pro和MDA含量的变化。结果表明,REC随温度降低逐渐增加,恢复生长后REC与对照之间没有显著差别。幼苗中的可溶性糖、可溶性蛋白、Pro及MDA含量在抗寒锻炼和低温处理后升高,恢复生长后又降低。不同处理的可溶性糖和Pro含量变幅较大,MDA和可溶性蛋白含量变幅较小。运用Fuzzy数学中隶属函数法进行抗寒性综合评价,得出火龙果扦插幼苗的抗寒性强弱表现为量天尺>晶红龙>粉红龙>紫红龙,这与幼苗的恢复生长试验结果基本一致,也与成年火龙果植株的抗寒性鉴定结果相同。(3)以成年火龙果植株的茎段作为外植体,通过愈伤组织分化成功再生出完整植株。重点研究了外植体表面灭菌方法、不同取样时间及取样部位、植物生长调节剂浓度及配比、培养条件等对茎段愈伤组织诱导、增殖及分化的影响。结果表明,适宜幼嫩茎段表面灭菌的方式为75%的酒精消毒30s+0.1%的升汞消毒6-8 min,适宜成熟茎段表面灭菌的方式为75%的酒精消毒30s+0.1%的升汞消毒12-15 mmin；以春季萌发的长10-20 cm枝条诱导愈伤组织效果较好,最适愈伤组织诱导的培养基为MS+TDZ 0.4 mg/L+KT 0.8 mg/L,暗培养7d,再转入光照培养,愈伤组织为黄绿色、致密状,外表有颗粒状突起。愈伤组织增殖培养基以MS+TDZ 0.4 mg/L+KTi(或ZT)0.8 mg/L效果较好,增殖系数达到8倍以上。在愈伤组织分化过程中,添加20-30%的椰子水对不定芽的形成具有一定的促进作用,但总体上愈伤分化率较低。(4)以紫红龙成年植株的茎段作为外植体,直接诱导不定芽再进行增殖培养。结果表明,保留刺座上小刺和绒毛的茎段,其不定芽的诱导率显著高于拔掉刺座上小刺和绒毛的茎段,而不带刺座的外植体不定芽诱导率为0。不定芽诱导率最高的培养基为MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.1-0.2 mg/L,而适宜不定芽增殖的培养基为MS +6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.1-0.2 mg/L+Tryptone 750 mg/L。(5)以从紫红龙成年植株茎段直接培养的无菌苗作为外植体,筛选出适宜火龙果芽苗茎段愈伤诱导和分化的培养基为MS+TDZ 0.4 mg/L+2,4-D 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L,愈伤组织的诱导率达到89.1%,且质量较好,不定芽诱导率达到94.0%。而最适芽苗生根的培养基为6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1-0.2 mg/L+CCC 0.5-1.0 mg/L+AC 0.03-0.05%,生根率达到98%以上；火龙果无菌苗的移栽成活率较高,用珍珠岩+腐殖土(2：1)和蛭石+腐殖土(1：1)移栽火龙果无菌苗成活率均达到100%,且幼苗长势较好。(6)以无菌条件下培养的单株紫红龙幼苗为试材,研究了EMS和60Coγ辐照处理及HYP选择压对芽苗成活及生长的影响。结果表明,将丛生芽切割成单株幼苗后继代培养15-30 d再对其进行EMS处理具有较好的适应性,以半致死浓度(LC50)和临界致死浓度(LC40)确定适宜火龙果无菌苗EMS诱变的浓度为3.71-3.95%,处理时间为8.26-9.32 h。低辐照强度(≤15 Gy)对无菌苗的成活及分化无明显影响,随辐射剂量增大,无菌苗的成活率和分化率显著降低,且对其生长的抑制作用越明显。以半致死剂量(LD50)和临界致死剂量(LD40)确定火龙果无菌苗辐照的适宜剂量范围为38.5-42.4Gy。火龙果无菌苗本身能忍受一定浓度(≤8 mmol/L)的HYP,而经EMS诱变处理过的无菌苗,在高浓度(20 mmol/L) HYP下的成活率显著高于未经EMS处理的对照植株。(7)无论经过EMS或60Coγ诱变与否,火龙果无菌苗的REC和MDA含量均随温度降低而明显增加,而叶绿素和类胡萝卜素含量则随温度降低明显降低,且温度越低、持续时间越长,增加和降低的幅度越大。低温对无菌苗的可溶性糖、可溶性蛋白和Pro等渗透调节物质影响较大,特别是可溶性蛋白含量对温度的变化更为敏感。各种抗氧化酶(SOD、POD、CAT和APX)活性随温度降低和处理时间延长变化规律不尽一致,但大多数酶活性在突然遭遇低温的初期都有一个显著上升的过程,但随温度继续下降或低温时间延长酶活性又逐渐降低。(8)通过抗寒生理初步检测,经EMS或60Co γ辐照处理,并通过HYP筛选后的火龙果无菌苗在不同低温和同一低温不同处理时间下均表现出比对照更强的抗寒能力,这可能与诱变处理后植物细胞产生了一定的抗寒突变体有关。(9)以EMS诱变初步筛选出的突变体材料10份和60Co γ辐照诱变初步筛选出的突变体材料4份进行REC和Pro检测及ISSR分析,以未经任何处理的材料作对照。结果表明,突变体的REC值较对照均有所降低,其中,5号突变体的REC较对照降幅最大。突变体中的Pro含量均显著高于对照。其中,5号突变体的Pro含量是对照的6.5倍,这与同一材料的REC鉴定结果一致,说明其抗寒力最强。利用筛选出9条ISSR引物对15份火龙果材料进行扩增,得到67条谱带,其中多态性带的比例为71.64%,说明供试材料的变异较为丰富。引物M06检测出5号突变体有一条特异谱带。采用NTSYS pc 2.1软件分析得出遗传距离为0.0120-0.3597,平均为0.2836,说明筛选出突变体变异率较高。UPGMA聚类分析表明,当遗传距离为0.11时,可将15份材料归为6类,其中,5、6、10、12和14号单独聚为一类,说明其发生变异较大。