目的:糖尿病肾病（diabetic nephropathy,DN）是终末期肾功能衰竭的主要原因之一,严重威胁着患者的生命和生活质量。DN的特征是细胞外基质（ECM）蛋白的积累。ECM沉积随后导致肾纤维化——肾小管间质纤维化、肾小球硬化、炎性介质的渗透,并激活α-SMA阳性的肌成纤维细胞^[1-3]。在高糖等病理性刺激下,部分肾小管上皮细胞会发生上皮间质转化（epithelial-to-mesenchymal transition,EMT）。大量文献表明EMT是糖尿病肾病肌成纤维细胞的主要来源。本课题组前期研究确定了两色金鸡菊黄酮类化合物对早期的糖尿病肾病具有保护作用。黄诺玛苷（flavanomarein,FM）为两色金鸡菊黄酮的主要活性成分之一。药代动力学研究结果表明,其黄酮类化合物在肾脏组织中黄诺玛苷浓度变化最为显著,最先达到最高值,且浓度最高,持续时间最长^[4],并以原型入血。在本研究中,我们研究了黄诺玛苷对高糖刺激的人肾小管上皮细胞（HK-2）的抗EMT作用及其机制,包括探索其直接的靶蛋白、下游信号相关蛋白以及通过外泌体的细胞通讯作用和载体作用而发挥的抗EMT作用的机制,以及黄诺玛苷通过旁分泌作用对人肾脏成纤维细胞KFB的影响,希望为两色金鸡菊的进一步开发利用、DN的新药研发提供理论依据。方法:1)通过DS 2017 R2配体-蛋白反向对接软件对FM的潜在靶蛋白进行了预测。2)根据所预测的15种蛋白,使用Cytoscape平台的BisoGenet软件构建了蛋白-蛋白相互作用,分析了各个靶蛋白的关系度。3)基因本体论（GO）丰富了15种蛋白质的生物学过程。4)通过分子动力学和表面等离子体共振（surface plasmon resonance analyses,SPR）方法分析研究黄诺玛苷与靶蛋白的特异性结合。5)采用MTS法,结合细胞形态学以及Western blot方法确定EMT的高糖造模浓度以及确定黄诺玛苷的有效抗EMT浓度,EMT的标记性蛋白选用纤维连接蛋白（FN）、E-钙粘蛋白、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、波形蛋白（Vimentin）。6)采用Western blot方法结合基因沉默技术,检测不同浓度FM对HK-2细胞中TGF-β1、Syk、Smad2/p-Smad2、Smad4蛋白的影响,研究黄诺玛苷的作用通路。7)通过Western blot方法对外泌体的标记性蛋白（CD9、CD63、Calnexin、TSG101）进行检测,结合电镜观察外泌体的形态、NTA检测外泌体的粒径共同鉴定HK-2细胞分泌的小囊泡是外泌体。8)采用Western blot方法检测黄诺玛苷、Syk抑制剂BAY61-3606（预测的FM的靶点的抑制剂）、洛沙坦（阳性对照）干预的外泌体对高糖诱导的HK-2细胞的抗EMT作用。9)采用外泌体蛋白质组学结合生物信息学分析方法研究黄诺玛苷、Syk抑制剂BAY61-3606、洛沙坦干预的外泌体对HK-2细胞的抗EMT的作用机制。10)采用Western blot方法结合基因沉默技术对蛋白组学结果进行验证以及通路研究。11)结合细胞免疫荧光技术、划痕实验以及Western blot方法探索黄诺玛苷、Syk抑制剂、洛沙坦干预的外泌体对高糖激活的KFB细胞的影响。结果:1)通过网络药理学,分子动力学以及SPR预测并验证了脾酪氨酸激酶（Syk）是黄诺玛苷与DN相关的直接靶点之一。2)黄诺玛苷能促进HK-2细胞的增殖,并通过Syk/TGF-β1/Smad信号通路抑制高糖诱导的HK-2细胞的EMT过程。3)HK-2细胞分泌的外泌体可以被自身重新摄取以及KFB细胞摄取,黄诺玛苷、Syk抑制剂干预的外泌体（从HK-2细胞分泌的）可以通过c-KIT/Syk/TGF-β1信号通路对高糖诱导的HK-2细胞产生抗EMT作用。4)通过外泌体蛋白质组学、生物信息学分析以及Western blot方法预测并验证了高糖、黄诺玛苷、Syk抑制剂BAY61-3606干预的外泌体对高糖诱导的HK-2细胞产生抗EMT的主要靶点之一是c-KIT。5)高糖干预的外泌体（从HK-2细胞分泌）会促进KFB细胞的增殖,迁移以及激活向肌成纤维细胞转化。6)黄诺玛苷、Syk抑制剂BAY61-3606、洛沙坦干预的外泌体（从HK-2细胞分泌的）可以抑制高糖诱导的KFB细胞的增殖,迁移以及向肌成纤维细胞转化。结论:黄诺玛苷可以通过Syk/TGF-β1/Smad信号通路,以及通过外泌体的旁分泌效应c-KIT/Syk/TGF-β1信号轴对高糖诱导的HK-2细胞产生抗EMT作用,FM干预的外泌体抑制高糖诱导的KFB细胞激活向肌成纤维细胞转化,通过以上研究希望为研制有效的新型DN治疗药物提供帮助。