研究背景干细胞研究一直是热点领域，研究人员几乎在所有的成体组织都发现了干细胞的存在。干细胞是具有自我更新和分化潜能特性的一类细胞。性腺作为将遗传物质传递给子代的唯一组织，有体细胞和生殖细胞两种细胞类型，在睾丸中已经证实有生殖系干细胞和成体干细胞的存在。在卵巢中，干细胞的存在至今仍有争议。干细胞不仅可以自我更新、分化，而且能够分泌多种生物活性因子，对邻近的器官或组织发挥营养、趋化等作用。干细胞的自我更新、成熟以及分化都与周围的微环境有关。骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cells, MSC)是一种成体干细胞，除了具有自我更新和多向分化的潜能外，还可以通过分泌多种细胞因子来发挥营养作用，参与构成造血微环境。在卵泡生长发育过程中，颗粒细胞、卵泡膜细胞、卵母细胞以及基质细胞也可以分泌一系列细胞因子来促进和/或调节卵母细胞的分化、发育和成熟过程。本课题组前期的研究发现，MSC条件培养液能显著提高小鼠裸卵、卵丘-卵母细胞复合物以及卵巢中卵母细胞的成熟率和质量，并且卵子受精率和囊胚形成率与体内成熟的卵母细胞相比无显著差异。既然MSC微环境对卵母细胞的发育具有调节作用，那么，与卵泡形成、发育、成熟及排卵紧密相关联的卵泡膜细胞对卵母细胞的发育有影响吗？卵泡膜细胞具有干细胞的功能特性吗？为了进一步阐明卵巢组织内是否存在卵泡膜干细胞（Theca stem cells, TSC）及其对卵母细胞发育的支持作用，我们首先要对其进行分离和鉴定，这将为具体的调节机制阐明提供更多的证据支持。在哺乳动物卵泡生长发育的过程中，卵母细胞由不断增加的颗粒细胞层包裹。卵巢组织中的膜细胞作为卵泡的外层细胞可以维持卵泡结构的完整性，参与构成卵母细胞和颗粒细胞发育的微环境且为类固醇激素的生成提供底物。在哺乳动物中调节膜细胞类固醇激素生成的机制已见相关报道，但是有关于卵泡膜细胞的聚集，生长和分化的研究不甚深入。1991年Hirshfield发现卵母细胞周围存在标记滞留细胞，为进一步证实卵泡膜干细胞的存在，本实验试图从新生小鼠卵巢组织中分离、培养卵泡膜干细胞，并鉴定其生物学特性。本课题的主要研究内容（1）分离培养体系的建立；（2）干细胞鉴定：包括形态鉴定、标记物鉴定及分化功能的鉴定。目的分离、培养、鉴定新生鼠卵巢组织中的卵泡膜干细胞，为进一步探讨卵泡膜干细胞微环境对卵泡生长及发育的调控作用奠定基础。方法⑴取2~4d新生鼠卵巢组织，胶原酶、胰蛋白酶联合消化获得单个细胞悬液，GSM-K无血清基培养细胞观察细胞球形成；⑵RT-PCR方法检测膜基因Ptch1和透明带基因Zp1、Zp2和Zp3的表达；⑶免疫荧光检测干细胞标记物碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,AKP）、Oct4、膜细胞标记物Gli3与颗粒细胞标记物FSHR的表达；⑷体外诱导分化，RT-PCR检测分化标记物Gli2的表达，油红O染色观察细胞胞浆的脂滴变化；⑸透射电镜观察细胞器的超微结构。结果⑴GSM-K中培养2d开始形成悬浮细胞球；⑵RT-PCR结果显示Ptch1表达阳性，不表达Zp1、Zp2、Zp3；免疫荧光结果显示AKP、Oct4和Gli3表达阳性，不表达FSHR；⑶诱导分化后，Gli2表达；油红O染色阳性；细胞呈分泌类固醇激素细胞的超微结构特点。结论新生鼠卵巢组织中存在卵泡膜干细胞，且具有分化潜能。