核酸检测具有与病原诊断同等的确诊价值，因此，核酸检测法用于血吸虫感染的诊断及疗效考核已成为近年来血吸虫病分子诊断技术的研究热点。靶序列的选择是决定核酸诊断方法敏感性及特异性的关键因素之一。本课题组前期获得的SjR2的230bp靶序列在日本血吸虫感染家兔及病人血清特异性DNA检测中显示了较好的敏感性和特异性。在此基础上，本研究通过对25个新发现的逆转录转座子DNA检测敏感性及特异性的研究，成功筛选到一段来自于逆转录转座子SjCHGCS19分子量为303bp的靶序列，探讨了日本血吸虫核酸检测靶序列的选择依据，进一步建立了303bp靶序列的nested-PCR检测法，显示了对日本血吸虫感染家兔模型的早期诊断和疗效考核价值，并评价了nested-PCR法应用于日本血吸虫病患者的诊断及疗效考核效果。同时本研究还初步建立了针对SjCHGCS19靶序列的LAMP法，并探讨了在血吸虫感染家兔血清DNA检测中的应用价值。全文共分五个部分：第一部分25个日本血吸虫逆转录转座子DNA诊断靶序列的筛选在本课题组前期研究中发现了来源于逆转录转座子SjR2分子量为230bp的靶序列，用于检测日本血吸虫感染宿主血清DNA，显示出高度的敏感性和特异性。本研究针对日本血吸虫基因组中新发现的25个逆转录转座子设计引物，应用普通PCR方法检测日本血吸虫、曼氏血吸虫、肝吸虫、肺吸虫及旋毛虫的DNA，评价不同靶序列检测血吸虫DNA的敏感性和特异性，以期寻找敏感、特异具有诊断价值的新靶序列，研究结果发现了来源于逆转录转座子SjCHGCS19（扩增区段为2049bp~2334bp）分子量为303bp的靶序列，用于检测日本血吸虫DNA显示出高度的敏感性（最高检测敏感性21.5fg/μL）。该靶序列与曼氏血吸虫具有交叉反应，而与肝吸虫、肺吸虫及旋毛虫均未出现交叉反应。第二部分25个日本血吸虫逆转录转座子DNA诊断靶序列的生物信息学分析本研究对SjR2及25个新的日本血吸虫逆转录转座子的基本生物信息学数据进行分析，探讨影响日本血吸虫DNA核酸检测敏感性及特异性的相关因素。采用SAS软件进行多重线性回归分析，发现日本血吸虫DNA的PCR检测敏感性与逆转录转座子的完整拷贝数及其ESTs活跃度呈密切相关，同时还受到逆转录转座子在整个血吸虫基因组中所占的比例等其它基本生物信息学特征的影响。进一步分析发现，已获得的2个具有高度检测敏感性和特异性的靶序列（230bp和303bp）分别来源于逆转录转座子SjR2和SjCHGCS19，二者在日本血吸虫基因组中均具有较高的完整拷贝数(分别是400，793)，更高的部分重复拷贝数(分别是23,755，17,373)及较高的ESTs活跃度(分别是79，39)，并且在系统进化树中同属于非长末端逆转录转座子的SR2家族。以上生物信息学分析结果表明，靶序列在基因组中的完整拷贝数及其ESTs活跃程度可能是决定日本血吸虫DNA检测敏感性的关键因素之一，而特异性则主要与靶序列和其它物种是否具有同源序列相关。第三部分逆转录转座子SjCHGCS19的303bp靶序列用于日本血吸虫感染宿主早期诊断及疗效考核以逆转录转座子SjCHGCS19的303bp片段为靶序列，通过nested-PCR方法探讨其用于日本血吸虫DNA检测的敏感性和特异性，同时应用于日本血吸虫不同感染度宿主外周血清的DNA检测，进一步探索该靶序列在日本血吸虫病早期诊断及疗效考核中的应用价值。以nested-PCR外引物扩增产物构建的重组质粒DNA作为模板，评价303bp靶序列检测DNA的敏感性，结果显示最高的检测敏感性可达2.02个拷贝，比230bp靶序列的检测敏感性（10.2个拷贝）高5倍。应用303bp靶序列对日本血吸虫感染家兔模型的不同组织样本(包括日本血吸虫成虫、感染家兔的肝组织和外周血清)均可以检测到日本血吸虫特异的DNA片段，该靶序列与曼氏血吸虫有交叉反应，而与肝吸虫、肺吸虫及旋毛虫均未出现交叉反应。在中、低度感染宿主血清中均可扩增出阳性条带，特别是可以从感染后第3d的家兔血清中扩增出特异条带，并于治疗后第18w即转为阴性。研究结果表明应用303bp靶序列检测日本血吸虫感染宿主血清特异性DNA具有早期诊断及疗效考核价值。第四部分303bp靶序列在日本血吸虫病患者诊断及疗效考核中的应用在动物模型实验研究取得较好效果的基础上，应用nested-PCR法评价303bp靶序列用于日本血吸虫病慢性期病人(EPG阳性)血清DNA的检测效果，结果显示，43例慢性病人血清及51例健康人血清检测结果的敏感性为97.7%，特异性为96.1%，阳性预测值为97.7%，阴性预测值为96.1%。其阳性检出率随着病人感染度的降低而降低，特别是对低度感染病人的阳性检出率仍然可以达到96.9%。进一步对47例治疗后3、6、9个月日本血吸虫病人血清DNA检测的疗效考核价值进行评价，结果表明其阴转率分别为36.2%、89.4%和87.2%，随治疗时间延长呈明显上升趋势，特别是治疗后6个月已达89.4%，显示出较好的疗效考核价值。而常规免疫学检测方法IHA检测的治疗后3、6、9个月病人血清抗体的阴转率分别为23.4%、42.6%和31.9%，ELISA法检测治疗后3、6、9个月病人血清抗体的阴转率分别为19.1%、17.0%和25.5%。第五部分基于逆转录转座子SjCHGCS19的靶序列筛选及LAMP法建立在逆转录转座子SjCHGCS19的303bp靶序列所建立的nested-PCR检测法取得较好敏感性和特异性的研究基础上，本研究进一步探索了灵敏度高，方法简便、快速更适宜于疫区现场应用的LAMP法，分别选取了逆转录转座子SjCHGCS19的4个不同区段作为扩增靶序列，结果发现扩增区段位于211bp~441bp处的一段靶序列显示了较好的检测敏感性，达到了130fg/μL。并在日本血吸虫感染200条、100条及50条尾蚴家兔模型血清中检测出阳性结果，但是未能检测出感染30条尾蚴的家兔血清DNA，低于来源于SjCHGCS19的303bp靶序列（扩增区段为2049~2334bp）建立的nested-PCR法的检测敏感性(21.5fg/μL)，及本课题组已经建立的基于SjR2的230bp的LAMP检测方法(0.08fg/μL)。其特异性检测结果显示与曼氏血吸虫具有交叉反应、而与肝吸虫、肺吸虫和旋毛虫均未出现交叉反应。本研究结果表明靶序列的选择在决定LAMP检测法的敏感性中具有至关重要的作用。