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1清肺饮加减治疗儿童细菌性肺炎的临床疗效评价目的:国医大师王烈教授经验方清肺饮(Qingfei Yin,QFY)治疗细菌性肺炎的临床疗效评价。方法:将76例细菌性肺炎患儿随机分为对照组(38例,脱落2例)和试验组(38例,脱落1例)。对照组予头孢类抗生素以基础治疗,试验组在对照组基础上予以QFY加减治疗。评价两组临床痊愈率、完全退热时间、抗生素应用天数、抗生素叠加或升级治疗率和安全性,以及治疗前后中医证候评分情况,以评定临床疗效。结果:试验组临床痊愈率为89.19%,略高于对照组的83.33%,但两组比较差异无统计学意义(P>0.05)。试验组患儿完全退热天数和抗生素应用天数均短于对照组(P<0.05),治疗后两组患儿中医证候各项积分均较治疗前下降(P<0.05)。但与对照组治疗后相比较,试验组治疗后患儿的咳嗽、咯痰、肺部听诊积分及次要症状流涕、咽红积分均有所下降(P<0.05)。此外,试验过程中发现对照组有10例患儿出现轻度腹泻现象,而试验组仅有2例轻度腹泻患儿。结论:在抗生素基础治疗上,联合QFY加减治疗后,能明显缩短患儿的完全退热天数、抗生素应用天数及抗生素升级发生率。同时,QFY能够明显改善咳嗽、咯痰、流涕和咽红等中医症状,减少腹泻症状,发挥减毒增效作用。2基于NLRP3/自噬信号通路探讨QFY治疗肺炎链球菌肺炎的抗炎机制目的:探讨QFY通过调控NOD样受体3(Nod-like receptor,pyrin domain containing 3,NLRP3)/自噬信号通路治疗肺炎链球菌肺炎的作用机制和靶点。方法:采用高效液相色谱-质谱联用(High-Performance Liquid ChromatographyMass,HPLC-MS/MS)法进行QFY成分鉴定。应用体内外两种肺炎模型评估QFY的抗肺炎作用。体内实验:应用肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae,S.pn)菌液左侧滴鼻以建立体内小鼠肺炎模型,通过微计算机断层扫描技术(micro computed tomography,Micro-CT)、苏木精伊红染色(Hematoxylin-eosin,H&E)染色法和酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)等方法评价QFY对肺炎小鼠的保护作用。采用非标定量(4D-lable free)蛋白质组学技术,分析QFY可能富集的生物学过程及信号通路。体外实验:应用肺炎链球菌溶血素(pneumolysin,PLY)刺激小鼠肺泡巨噬细胞(Mouse alveolar macrophages,MHS),建立体外炎症损伤模型。采用蛋白质印迹法(Western Blot)、免疫组化(Immunohistochemistry,IHC)、斯皮尔曼相关系数分析并结合自噬抑制剂及NLRP3小干扰RNA转染(small interfering RNA,si RNA)等方法分别检测体内外NLRP3/自噬通路相关蛋白表达情况,以明确QFY调节NLRP3/自噬信号通路的作用机制。结果:HPLC-MS/MS法确定了QFY复方中包括黄芩素、黄芩苷、连翘苷、连翘酯苷、野鸢尾苷等19种成分,同时计算10批复方各色谱峰相似度,范围均在95%至98%内,表明QFY复方总体质量具有良好的可重复性。小鼠Micro-CT和H&E染色结果显示,S.pn感染后小鼠肺间质弥漫性出血,肺泡壁大面积增厚,肺泡、支气管腔内可见大量红细胞渗出和炎症细胞浸润。QFY治疗后小鼠肺间质及肺泡毛细血管扩张、出血、炎症细胞浸润程度均减轻,且白细胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(Tumor Necrosis Factor,TNF-α)炎症因子含量和肺组织炎症评分均明显降低(P<0.01),差异有统计学意义。4D-labbel free蛋白质组学技术分析显示,QFY治疗后共有345个差异蛋白,在宿主免疫、炎症反应和防御机制等通路中均有显著富集,其中NOD样受体和自噬通路中超过40个蛋白表达发生显著变化。为进一步探索QFY治疗细菌性肺炎的具体作用机制及靶点,以NLRP3/自噬信号通路为切入点,S.pn和PLY感染后,NLRP3和核因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)信号通路被启动。然而,进行QFY干预后,NLRP3和NF-κB信号通路受抑制,NLRP3炎症小体相关蛋白NLRP3、凋亡相关斑点样蛋白(Apoptosis-Associated Speck-Like Protein,ASC)、剪切的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶1(cleaved-cysteinyl aspartate specific proteinase-1,cleavedCasp-1)、IL-1β和NF-κB蛋白表达均明显下调。与此同时,QFY能够启动S.pn感染导致的受损自噬,并进一步结合自噬特异性抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine,3-MA)及NLPR3 si RNA转染方法,明确了QFY是通过抑制NLRP3/m TOR信号通路来启动自噬,进而减轻炎症反应。结论:基于体内外实验,验证了QFY通过抑制NLRP3/m TOR信号通路启动自噬,减轻肺部损伤,发挥抗炎的生物学效应。3基于“肺-肠轴”探讨QFY调节肠道菌群和短链脂肪酸的作用机制目的:基于“肺-肠轴”探讨QFY调节肠道菌群及其代谢产物短链脂肪酸(short-chain fatty acids,SCFAs)的作用机制。方法:应用16S r RNA高通量测序技术检测各组小鼠盲肠内容物中肠道菌群的多样性和物种组成,以研究S.pn和QFY对小鼠肠道菌群的影响。分析各组高产短链脂肪酸(short-chain fatty acids,SCFAs)的益生菌菌群相对丰度,并检测各组小鼠盲肠内容物中SCFAs含量,以研究QFY对SCFAs含量的影响。广谱抗生素构建伪无菌(depleted-gut,DEPL)小鼠模型,应用H&E、ELISA和Western Blot等方法,评价QFY和SCFAs对S.pn感染的DEPL小鼠肺炎的保护作用及对NF-κB-NLRP3炎症通路的调控作用。结果:16S r RNA高通量测序分析显示,S.pn感染导致了小鼠肠道菌群多样性降低和物种结构紊乱,其中劳尔氏菌属(Ralstonia)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、苍白杆菌属(Ochrobactrum)和链球菌属(Streptococcus)等有害菌相对丰度升高,高产SCFAs的一些益生菌相对丰度显著下降,如:粪球菌属(Coprococcus)、普氏菌属(Prevotella)、丁酸梭菌属(Butyricicoccus)、瘤胃球菌属([Ruminococcus])、理研菌属(Rikenella)、脱囟球菌属(Dehalobacterium)和狄氏副拟杆菌属(Parabacteroides)等。然而,QFY治疗后上述产生SCFAs的益生菌菌群丰度显著回调,物种结构和组成更趋近于健康水平,并提高了SCFAs中乙酸和丁酸的含量。为进一步分析肠道菌群与SCFAs之间的关系以及QFY在两者之间的调节作用,应用广谱抗生素建立DEPL小鼠,结果提示肠道菌群的缺失抵消了QFY的抗肺炎作用。然而,在S.pn感染的DEPL小鼠中直接给予乙酸和丁酸,可通过抑制NF-κB-NLRP3信号通路发挥抗炎作用。结论:QFY通过促进SCFAs的生成,改善S.pn感染引起的肠道菌群紊乱。本研究为“肺-肠轴”的存在提供了进一步的佐证依据,并明确了QFY抗炎和调节机体免疫的潜在作用机制,为未来开发新的抗感染策略和减少抗生素滥用奠定了实验基础。