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研究背景高强度聚焦超声（High Intensity Focused Ultrasound,HIFU）作为非侵入性治疗实体肿瘤的技术已广泛应用于肿瘤治疗,然而当肿瘤边界不清晰、形态不规则时,一次消融后可能存在残余癌组织导致肿瘤复发。HIFU协同化疗可提高治疗效果,但现有协同治疗方式缺乏靶向性,导致肿瘤部位药物浓度低,削弱治疗效果,再加上传统化疗药物毒副作用大、存在乏氧抵抗性,因此HIFU协同治疗的有效性和安全性有待进一步提高。双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum,B.bifidum）可靶向肿瘤乏氧区,作为靶向载体已应用于基因治疗。乏氧激活药物利用肿瘤乏氧环境发挥抗肿瘤效果,同时避免对正常组织的副作用。因此,基于肿瘤存在乏氧区,结合双歧杆菌和乏氧激活药物再协同HIFU靶向治疗乳腺癌,有望提高治疗效果和安全性。目的探究双歧杆菌联合载PFH/TPZ的阳离子脂质体（PFH and TPZ co-loaded cationic liposomes,PT-CLs）协同HIFU靶向治疗乳腺癌的有效性和安全性,以期为HIFU协同治疗提供新思路。方法1.PT-CLs纳米粒与双歧杆菌的体外连接:利用薄膜水化-超声震荡法制备PT-CLs纳米粒,检测纳米粒粒径、电位、包封率、载药率等基本表征,培养双歧杆菌,通过静电吸附法连接双歧杆菌和纳米粒,共聚焦显微镜和流式细胞仪检测连接效果。2.双歧杆菌与PT-CLs纳米粒体内靶向性及对肿瘤乏氧状态的影响:建立4T1荷瘤鼠模型5只,连续3 d经尾静脉注射双歧杆菌,7 d后处死荷瘤鼠,剥离主要器官和肿瘤,组织匀浆法验证双歧杆菌肿瘤靶向性;设置B.bifidum+PT-CLs纳米粒组,PT-CLs纳米粒组,每组3只荷瘤鼠,活体荧光成像仪观察PT-CLs纳米粒在两组荷瘤鼠体内分布情况以评价纳米粒肿瘤靶向性;设置PBS组,B.bifidum组,两组分别经尾静脉连续3 d注射PBS和B.bifidum,7 d后进行CD31免疫荧光和缺氧免疫荧光检测以探讨双歧杆菌对肿瘤血管及乏氧状态的影响。3.PT-CLs纳米粒体外增效HIFU及杀伤肿瘤细胞效果:设置生理盐水组,空白脂质体组,T-CLs纳米粒组,PT-CLs纳米粒组（n=3）,各组协同HIFU消融牛肝组织,计算凝固性坏死体积以及EEF值评估增效HIFU的能力,采集HIFU辐照纳米粒后的超声图以评价各组成像效果;设置空白组,对照组,常氧+纳米粒+HIFU组,乏氧+纳米粒+HIFU组,通过MTT检测,凋亡实验,CAM-PI荧光双染等探讨各组对4T1乳腺癌细胞杀伤效果。4.双歧杆菌联合PT-CLs纳米粒协同HIFU治疗乳腺癌的有效性及安全性:（1）有效性:建立4T1荷瘤鼠模型,分为生理盐水组,PT-CLs组,B.bifidum组,B.bifidum+PT-CLs组,HIFU辐照后计算各组肿瘤凝固性坏死体积以及EEF值以评价体内增效HIFU效果;另外设置对照组,PBS+HIFU组,PT-CLs+HIFU组,P-CLs+HIFU+B.bifidum组,PT-CLs+B.bifidum+HIFU组,每组5只荷瘤鼠,通过记录各组协同治疗后14天内肿瘤体积变化以及肿瘤HE、TUNEL、PCNA病理切片综合考察治疗的有效性;（2）安全性:剥离各组主要器官进行HE染色;采集对照组及经尾静脉注射PT-CLs纳米粒后第3 d,7 d,14 d的BALB/C鼠血样（n=3）进行血生化、血常规检测。结果1.PT-CLs纳米粒与双歧杆菌体外连接效果:共聚焦显微镜下观察到双歧杆菌表面吸附大量PT-CLs纳米粒,流式细胞术测得二者体外连接率为（99.2±0.3）%,表明成功连接,其中PT-CLs纳米粒形态规则、大小均一,粒径约为244.8 nm,电位+55.8 m V,成功包载PFH和TPZ,TPZ包封率和载药率分别为43.40%、3.97%。2.双歧杆菌与PT-CLs纳米粒体内靶向性以及对肿瘤乏氧环境的影响:组织匀浆验证双歧杆菌主要定植于肿瘤,其余器官组织无明显菌落生长;活体荧光成像结果表明,B.bifidum+PT-CLs组的纳米粒具有良好肿瘤靶向性,与对照组相比肿瘤部位荧光信号值更强,差异具有统计学意义（*P<0.05）;CD31免疫荧光及缺氧探针试剂盒检测发现注射双歧杆菌后肿瘤组织血管密度为（1.3±0.42）%,缺氧面积为（76.45±9.79）%,对照组血管密度为（2.98±0.39）%,缺氧面积为（19.91±11.32）%,差异具有统计学意义（*P<0.05）,说明双歧杆菌可抑制血管生长,提升乏氧水平。3.PT-CLs纳米粒体外增效HIFU及杀伤肿瘤细胞效果:与其余各组比较,PT-CLs纳米粒协同HIFU消融牛肝组织后,凝固性坏死体积最大,具有最好增效HIFU和超声成像效果;MTT、凋亡实验、CAM-PI荧光双染结果表明乏氧+纳米粒+HIFU组具备较好抗肿瘤活性,与常氧+纳米粒+HIFU组相比差异都具有统计学意义(***P<0.001)。4.双歧杆菌联合PT-CLs纳米粒协同HIFU治疗乳腺癌有效性及安全性:（1）有效性:HIFU辐照后,B.bifidum+PT-CLs组肿瘤凝固性坏死体积为（88.76±13.7）mm~3,消融效果最明显,具有良好体内增效HIFU及超声成像效果;单纯HIFU治疗后2周肿瘤体积增长为治疗前的5倍,而PT-CLs+B.bifidum+HIFU组协同治疗后肿瘤体积无明显增长,差异具有统计学意义(**P<0.01),切片结果显示,PT-CLs+B.bifidum+HIFU组肿瘤增殖不明显,具有较好肿瘤抑制效果;（2）安全性:治疗后各组主要器官病理切片都无异常,注射PT-CLs纳米粒后各组血生化、血常规检测结果都在正常范围内,与对照组比差异无统计学意义（P>0.05）。结论双歧杆菌联合PT-CLs纳米粒可靶向肿瘤,再协同HIFU治疗乳腺癌,提高了治疗的有效性和安全性。