传染病自古以来便威胁着人类生命健康安全,是造成人类死亡的重要杀手,全球每年死亡人数中有1/4是死于传染病,加之新发突发传染病疫情频繁发生带来的全球性灾难和恐慌,使得临床诊断和治疗面临着前所未有的挑战。传统的传染病诊断方法主要包括病原学检测、免疫学检测以及分子生物学检测。但基于病原学的分离培养法具有耗时久、需要具有专业操作技能的工作人员投入大量的精力、敏感性低、阳性率低、以及早期诊断易漏诊等限制与不足,并不适用于传染病监测和现场检测,尤其在大规模疫情爆发时。免疫学检测主要是利用抗原抗体特异性的结合反应,常见的有ELISA、胶体金免疫层析等。但由于发病期间抗原抗体产生的量、出现时间的早晚以及交叉反应等因素,使这种方法容易出现假阴性或假阳性结果。分子生物学技术中的普通PCR,以及Real-Time PCR等变温核酸扩增技术都不可避免的要经历变性、退火、延伸等热循环步骤,需要具备精密昂贵的PCR扩增仪器才能实现核酸扩增,限制了其在基层单位以及现场简陋条件的应用,加之扩增时间长,成本又高,所以并不适合传染病的现场检测和床旁诊断。因此,研究和发展一种快速高效、操作简便、灵敏可靠的检测技术,对传染病的诊断、治疗和疫情的控制具有重要意义。重组酶聚合酶核酸扩增(RPA,Recombinase Polymerase Amplification)是一种基于重组酶聚合酶反应原理核酸恒温扩增新技术,利用该技术在25-42℃恒温条件下,20min内即可完成核酸扩增,敏感性高,特异性强,且操作简便。本研究以布鲁氏菌、腺病毒和埃博拉病毒分别作为细菌、DNA病毒和RNA病毒的代表,建立这3种病原体的RPA检测方法,使临床和现场疫情防控中传染病病原体的快速检测成为可能。一、布鲁氏菌RPA检测方法的建立与应用本研究以布鲁氏菌为研究对象,建立布鲁氏菌RPA的检测方法并利用临床样本进行检测效果评价。具体步骤包括:(1)查阅文献,确定靶标基因;(2)根据RPA引物及探针设计原则,设计并合成8条正反向候选引物及探针;(3)筛选最佳引物组合进而建立RPA最佳反应体系;(4)构建阳性对照质粒,对RPA进行敏感性评价;(5)利用其它病原菌进行特异性评价;(6)临床样本的检测应用。实验结果显示布鲁氏菌rpa检测方法的最佳引物组合为bru-rpa-f1和bru-rpa-r3,达到阈值所需时间仅为4min,而荧光信号强度则达到了666.5int[mv],灵敏度高达为3copies/μl,特异性好。临床样本检测中,5名经rt-pcr检测为阳性的病人血样经rpa检测也为阳性,阈时间分别7.8min、10min、13.1min、13.8min、18.8min。为了进一步验证布鲁氏菌rpa检测方法的正确性,我们对扩增产物进行测序,测序结果与靶标序列一致,表明扩增是序列是正确的。二、腺病毒rpa检测方法的建立通过系统比较腺病毒基因组序列,筛选出高度保守的区域作为靶标区域。根据保守序列的区域,设计了探针和引物,筛选最佳引物组合,建立方法,并对方法的敏感性和特异性进行测试。结果显示,腺病毒rpa检测方法的最佳引物为adv-rpa-f1和adv-rpa-r4,该组引物达到阈值所需时间不到2min,灵敏度可以达到至少10个拷贝数每微升,特异性测试显示,腺病毒rpa检测方法能够特异检测到腺病毒的核酸,而其它病原的核酸没有扩增,显示了较好的特异性。三、埃博拉rpa检测方法的建立与应用根据2014年爆发疫情病毒基因组序列,针对n蛋白的基因序列设计引物探针,人工合成阳性对照序列并构建假病毒载体,获得阳性对照。筛选最佳的引物组合,建立rpa检测方法。建立简便的样本快速处理方法,筛选适合rpa的样本处理方法。结果显示,埃博拉病毒rpa检测方法的最佳引物为ebov-rpa-f2和ebov-rpa-r2,其灵敏度可以达到10个拷贝数,特异性好。在应用评价中,对375份样本进行了评估分析,与rt-pcr对比,ebov-rpa总体敏感性97%(95%ci:95.5–99.3);总体特异性97%,(95%ci:93.9–100);阳性预测值、阴性预测值、阳性似然比和阴性似然比分别为99%,94%,33.8,和0.03。在rt-pcr检测为阳性的样本(264名)中,对于ct值小于34的样本(255名)来说,其敏感性达到了100%。而对于那些检测不一致的样本,即rt-pcr检测为阳性ebov-rpa检测却为阴性的样本,其ct值都很高。本研究还利用盲样对ebov-rpa进行了eqa评价,结果显示其百分百正确。综上所述,本研究以布鲁氏菌、腺病毒和埃博拉病毒重要传染病病原体为研究对象,分别建立了针对细菌、dna病毒和rna病毒的rpa检测方法。结果显示,随待检测病原种类的不同,rpa检测方法的关键点是有差异的,这也正是确保rpa检测敏感性的关键。通过以上研究,对于常见重要的不同种类的病原,发现了rpa检测的关键环节,为将来其它病原的检测方法的建立奠定了基础。RPA方法的应用评价显示,其敏感性和可靠性能与Real-time PCR相媲美,但反应时间却大大缩短,在传染病床旁诊断以及新发突发检测中具有广阔的应用前景。