金属硫蛋白(Metallothionein,MT)是一类富含半胱氨酸的低分子量蛋白。除了参与金属代谢、解毒以及清除羟基自由基之外，该家族成员与各种肿瘤的关系越来越引起人们的重视。肝脏是人体多能性器官，具有解毒，物质合成，调节营养代谢平衡的功能。一些疾病如：肝癌，乙肝，肝硬化会引起肝功能的失调。肝细胞癌(Hepatocellular Carcinomas,HCC)是我国人群中高发的一类恶性肿瘤，尤其是我国的东南部。寻找肝癌相关基因并研究其生物学功能对于了解肝癌的发生发展、揭示肝癌的发生机制、早期诊断和治疗有着重要的理论和实际意义。 在对肝细胞与肝癌细胞的差异表达研究中，我们得到了一条300bp的cDNA，它在肝癌细胞中的表达显著下调，以此cDNA序列为探针，我们在NCBI数据库中筛查EST文库，拼接出447bp的全长cDNA序列。其开放阅读框编码61个氨基酸，在阅读框两侧设计引物，经PCR扩增，测序，证实序列一致。此外，基因组序列也经PCR扩增，测序验证，序列长1753bp，包括三个外显子和两个内含子，与人金属硫蛋白家族其他同源基因结构类似。蛋白质编码分析是金属硫蛋白，经查新验证发现为一个新的基因，即金属硫蛋白家族的新成员，将该基因送国际基因命名委员会并被命名为MT1M。生物信息学分析MT1M位于人的第16号染色体。利用人16种组织的杂交膜对MT1M基因的组织表达谱进行了检测，Northern杂交结果显示在肝、肾和胰腺组织中高表达，在心脏、骨骼肌、前列腺、小肠和结肠组织中呈中度表达，而在脾、胸腺、睾丸、卵巢、外周血淋巴细胞、脑、胎盘和肺组织中呈低表达。为了探讨MT1M与肝癌发生的关系，我们首先用Northern Blot方法检测8对肝癌及癌旁组织及2例胎肝组织，结果显示8对肝癌及癌旁组织中有7对呈现下调表达，而2例胎肝组织则无明显变化。58对肝癌及癌旁组织的半定量RT-PCR分析显示有51对呈现下调表达。结果提示MT1M基因与肝癌的发生有密切关系。 通过构建原核表达载体，我们在原核表达系统中对MT1M基因进行了重组表达并获得了纯化的蛋白。以重组蛋白为抗原我们制备了兔源的多克隆抗体，并用它进行肝癌及癌旁组织的免疫组化研究。从蛋白水平证明MT1M的表达是在癌旁组织，肝癌组织则呈下调表达，并且定位在细胞浆。我们通过Northern杂交和RT-PCR检测了肝癌细胞株中MT1M基因的表达，在L-02，Hep-G2，YY-8103，SK-hep-1，Focus，Huh-7，Hep-3B，BEL-7402及QGY-7703九株肝癌细胞株中，半定量RT-PCR检测MT1M基因的表达结博士学位论文 人肝癌低表达基因MT M的克隆和功能研究果：Hub司表达量最高；HepGZ次之；随后是 YYSI 03，SK人ep、Focus、L02和QGY7703；BEL－7402和Hep3B表达量很低。Northern杂交检测结果与半定量RTPCR检测结果基本一致。用 Northe。杂交检测显示低剂量 As。O。可诱导部分肝癌细胞株MT基因的表达。同时我们用MTS方法观察不同剂量的三氧化二砷（AS203）在不同时间（24h、48h、72h）对这些肝癌细胞株的毒性作用。结果表明，ASZO；在一定浓度范围内，L02，Hep－GZ细胞几乎不受AszO3的影响，对Hep｝B、BEL刁402、Hub7细胞有作用；对 SK人eP、YYSI 03细胞作用较强，即不同的肝癌细胞株对药物的敏感性有所不同。为了进一步探讨 MT与肝癌之间的关系，我们构建了真核表达载体并转染肝癌细胞株，观察TMTIM基因在此p－GZ细胞中可能参与的信号通路。用MTIM基因瞬时转染HepGZ细胞检测NFkB和AP的转录，结果发现MTIM能促进NFkB转录活化；影响 NF一肥信号通路；对 API活化的 WK信号通路无明显影响。提示 MTIM介导NF一肥的抗凋亡作用。 本研究首次克隆了一个金属硫蛋白家族的新成员 MT，并在基因水平、蛋白水平和细胞水平探讨了其与肝癌之间的关系，这些结果提示肝癌的发生机制是一个涉及到众多领域的复杂过程，我们的研究仅从某一个方面揭示MTIM与肝癌发生的相关性，同时MTIM表达量不同的肝癌细胞株对ASZO3的敏感性有所不同，提示MTIM可能作为指导II＄床用药的标志之一。有待进一步研究验证。