目的:PD-1/PD-L1（programmed cell death-1/programmed cell death ligand-1,程序性死亡受体1/程序性死亡受体-配体1）信号通路是近年来肿瘤免疫治疗研究的热点。骨和软组织肉瘤恶性程度高,形态分类复杂多样,放化疗敏感性差,免疫治疗可能是其治疗发展的新方向。研究表明,肿瘤细胞可通过PD-1/PD-L1轴抑制T细胞逃避免疫监视。PD-1/PD-L1药物能够特异性作用于T细胞,增强机体T细胞的免疫杀伤功能,从而在肿瘤治疗中取得了“突破性”的效果。然而,由于患者对药物的反应不同,只有一部分患者获得临床受益。因此,有必要提高免疫疗法的功效,并且迫切需要进一步筛选具有阳性表达的患者。核医学分子影像技术为肿瘤的早期诊断和预后提供了很好的手段,利用放射性分子探针可以无创地检测及评估肿瘤内PD-1/PD-L1受体蛋白的表达水平,从而进一步指导肿瘤患者的免疫治疗。本研究分别对具有PD-1/PD-L1靶向的抗体进行修饰及放射性标记,开发出两个可用于的PD-1/PD-L1特异性成像的PET分子无创探针,并进行肿瘤内PD-1/PD-L1受体蛋白的分子显像,旨在避免有创病理切片及治疗手段对机体PD-1/PD-L1表达水平的影响。方法:正电子核素124I通过HM-20医用回旋加速器自行生产。首先是关于PD-1单克隆抗体分子探针的实验研究,JS001（toripalimab,特瑞普利单抗）是一种人源化Ig G单克隆抗体,可强烈抑制PD-1受体。在本项研究中,使用系列碘同位素(nat/124/125/131I)标记JS001单克隆抗体制备探针并进行质量控制,以靶向h PD-1受体蛋白。本研究比较了natI标记前后JS001的EC50值,并采用PHA（Phytohemagglutinin,植物血凝素）刺激T细胞活化,使用Western blot和流式细胞仪鉴定h PD-1在T细胞中的过度表达。然后在体外进行细胞实验（细胞摄取,Kd测量）,评估125I-JS001探针在体外对T细胞的特异性靶向亲和力。构建人源化的PD-1 C57BL/6荷瘤鼠动物模型并进行聚合酶链反应（PCR）和Western印迹分析验证相应h PD-1受体蛋白的表达。同时取少量人源化的PD-1C57BL/6小鼠的肌肉和脾脏组织进行基因测序。在免疫PET成像验证后,包括IHC（immunohistochemistry,免疫组织化学）和IF（immunofluorescent,免疫荧光染色）在内的病理染色均用于确定肿瘤组织中h PD-1的表达。关于PD-L1重链抗体分子探针的实验研究,本研究使用噬菌体展示技术,制备一种新型的抗h PD-L1重链抗体（HCAb）,命名为Nb6,其对h PD-L1受体具有高度亲和力。使用系列碘同位素(nat/124/125I)来标记anti-h PD-L1 Nb6制备探针并进行质量控制,以靶向h PD-L1受体蛋白。Elisa（enzyme-linked immuno sorbent assay,酶联免疫吸附测定）法比较natI标记前后anti-h PD-L1 Nb6的EC50值。用流式细胞仪和免疫荧光染色鉴定h PD-L1在OS-732骨肉瘤细胞中的表达。细胞摄取和Kd测量用于评估125I-anti-h PD-L1 Nb6探针在体外对OS-732的特异性靶向亲和力。构建OS-732荷瘤鼠动物模型并进行聚合酶链反应（PCR）和Western印迹分析验证。最后进行靶向h PD-L1受体蛋白124I-anti-h PD-L1 Nb6探针的免疫PET成像验证,并与病理染色相对应。结果:第一部分,PD-1受体的靶向PET探针开发:体外,通过比较natI-JS001和JS001,JS001标记前后EC50值分别为0.89±0.15 ng/m L和1.03±0.14 ng/m L,标记前后的EC50值没有发现显着的统计学差异。孵育2小时后,活化的T细胞对125I-JS001探针的摄取是未活化的T细胞的5.63倍。共孵育过量JS001可以减少T细胞对125I-JS001探针的摄取,孵育2小时后,未阻断组探针摄取是阻断组的1.91倍。研究结果表明,PHA刺激后125I-JS001与T细胞的亲和力为4.26n M。通过基因测序,证实了人源化的PD-1 C57BL/6小鼠PD-1基因序列与人的PD-1基因序列高度相似,测序样品与人c DNA的序列相似性为>99.9%,与普通小鼠c DNA的序列相似性为68.23%。携带S180肉瘤的人源化PD-1 C57BL/6荷瘤鼠通过h PD-1免疫PET成像验证。在人源化PD-1 C57BL/6小鼠S180肉瘤模型中,不同时间点124I-JS001组在肿瘤区域对探针摄取明显高于阻断组或124I-h Ig G组,验证了124I-JS001探针的特异靶向性。IHC和IF染色证实PD-1受体蛋白表达于肿瘤组织内的T细胞表面。第二部分,PD-L1受体的靶向PET探针开发:比较anti-h PD-L1 Nb6和natI-anti-h PD-L1 Nb6两组的EC50值也没有发现显着差异。anti-h PD-L1 Nb6标记前后EC50值分别为0.65±0.08 ng/m L和0.70±0.09 ng/m L。共孵育过量的前体（anti-h PD-L1 Nb6）可以减少OS-732细胞对125I-anti-h PD-L1 Nb6的摄取,孵育2小时后,未阻断组探针摄取是阻断组的8.73倍。125I-anti-h PD-L1 Nb6对OS-732细胞的亲和力为2.19 n M,显示出良好的靶向能力。为了进行体内研究,研究者成功构建了OS-732骨肉瘤荷瘤鼠模型并通过免疫PET/CT成像验证。124I标记的探针特异性靶向人骨肉瘤细胞膜表面的h PD-L1受体,并可在体内行长达120 h的PET/CT成像。最后,病理染色证实了h PD-L1受体蛋白在OS-732肿瘤细胞膜表面的表达,这也与PET成像结果相一致。结论:124I-JS001和124I-anti-h PD-L1 Nb6探针均可用于体内无创PET成像。124I-JS001放射性示踪剂具有用于PD-1阳性肿瘤的无创监测和指导肿瘤特异性个性化免疫疗法的潜力,这可能为指导患者选择PD-1肿瘤免疫疗法提供了新的策略。另外,124I-anti-h PD-L1 Nb6可能为临床筛查h PD-L1阳性的患者提供一种新颖的策略,帮助鉴定出可从恶性肿瘤（如骨肉瘤）的免疫疗法中受益的患者。124I-anti-h PD-L1 Nb6可能成为在包括骨肉瘤在内的恶性肿瘤中实施免疫疗法的重要工具。