氢能源以其燃烧值高、清洁无污染、适用范围广等诸多优点，被认为是未来最理想的替代能源。生物制氢的方法有多种，其中厌氧发酵制氢，即通过细菌分解发酵将储存在不同形式的生物质中的能量释放、并转化为氢的过程被认为具有潜在的应用前景。　　 木质纤维素类生物质是全球最大量的可再生资源，可作为生产多种生物可再生能源的发酵原料，包括生物制氢。如农作物秸秆、牧草和其它农业废弃物。木质纤维素由纤维素，半纤维素和木质素主要成分组成，其中前两种成分都是单糖分子的链状大分子聚合物。当纤维素和半纤维素被降解为单糖后，则可被厌氧发酵细菌发酵产氢。　　 本课题选择了转化生物质产生再生能源的两个关键步骤--厌氧产氢和纤维素降解为研究对象，通过对厌氧产氢反应器中的厌氧产氢细菌的多样性分析，和筛选表达牦牛瘤胃微生物降解木质纤维素酶的基因，目的是获得高效的产氢微生物物种(群体)和纤维素降解酶，为从生物质制氢的生物技术提供具有开发价值的微生物和酶资源。　　 论文的第一部分旨在研究厌氧发酵产氢细菌资源，并对典型菌株进行了系统的生物学特性和分子系统学研究。主要研究结果如下：　　 利用电镜观察中温和高温UASB产氢反应器的颗粒污泥的内部结构，发现活跃的细胞多位于颗粒污泥的边缘部位，说明能否有效地从环境中吸取营养物资和及时释放代谢废物对于微生物的生长是至关重要的。直接提取高温UASB产氢反应器颗粒污泥的总DNA，PCR扩增到915 bp的16S rDNA片段，对22个克隆的测序分析，显示高温UASB产氢反应器污泥颗粒中大部分细菌与Thermoanaerobacterium bryantii(32％)和Thermoanaerobacteriumthermosulfurgenes(27％)亲缘关系较近。　　 利用Hungate滚管技术，从中温UASB产氢反应器污泥颗粒中分离到3株发酵葡萄糖产氢的菌株SW408T，SW512T和W72，均为乙醇型发酵细菌。表型、基因组DNA和16S rRNA基因的系统发育分析表明它们与已发表种类差别显著，代表了新的分类单元，因此新立了一个新属和一个新种，分别命名为Clostridium amylolyticum(菌株SW408T=JCM14823T=AS1.3489T)，和Hydrogenoanaerobacterium saccharovorans(菌株SW512=JCM14861T=AS1.5070T和W72)。　　 为了提高一株乙醇乙酸发酵型的高温厌氧产氢细菌-Thermobrachium celereT42的产氢效率，探讨了利用化学诱变和基因插入失活方法，改造代谢途径的可行性。通过诱变获得了4株产氢量提高的菌株，与野生株相比，产量提高幅度在19.3-30.8％之间。敲除乙醇脱氢酶基因的试验没有成功，对可能的原因进行了分析。　　 论文的第二部分的目的是获得牦牛瘤胃微生物纤维素降解基因。从已构建的牦牛瘤胃内容物的BAC文库中共筛选到116个具有内切葡聚糖苷酶活性和87个具有酯酶活性的克隆。构建了其中两个BAC克隆的亚克隆质粒文库，从中分别筛选到能够降解羧甲基纤维素(CMC)的活性亚克隆sub3和sub65。亚克隆sub3包含两个相连的开放读码框(ORF)，基因注释分别为假定的Zn++金属蛋白酶(identity为81％)和Appr-1-p processing(identity为44％)；亚克隆sub65含有一个ORF，基因注释为GH5家族的内切葡聚糖苷酶。　　 3个ORF分别在大肠杆菌BL21菌株中获得了异源表达。亚克隆sub65的ORF的异源表达产物经Ni+亲和层析获得了初步纯化的蛋白，酶活性测定显示具有数种多糖降解酶活，包括内切葡聚糖酶、木聚糖酶和果胶酶，但内切葡聚糖酶最高。而纯化的亚克隆sub3的两个ORF的异源表达蛋白均无糖苷酶活性，尽管亚克隆sub3具有酶活。对sub3的全细胞蛋白经Blue-native PAGE后的活性条带的肽段质谱测定结果的分析显示具有酶活的蛋白条带不是由sub3的2个ORF表达的，推测这两个ORF可能影响了大肠杆菌自身的基因表达。