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在脂肪和肌肉细胞中,由胰岛素刺激引起的葡萄糖吸收对于降低膳后血糖浓度非常关键,这一个过程的失调也是二型糖尿病的标志之一。GLUT4是脂肪和肌肉细胞中主要的葡萄糖转运蛋白,在葡萄糖吸收中发挥重要作用。在胰岛素的作用下,GLUT4以囊泡的方式从细胞内特定区域转运到细胞表面,这一过程受其它蛋白分子的共同调节。在GLUT4转运过程中,主要有两条信号通路发挥作用:PI3K依赖和PI3K非依赖的信号通路。PI3K依赖的信号通路通过一些蛋白激酶的级联放大将胞外胰岛素信号传导至细胞内,引起储存GLUT4的囊泡(GSVs)向细胞膜靠近。AS160是Akt的底物,受Akt的磷酸化,在PI3K依赖的信号通路中发挥重要作用。在胰岛素作用下,Syntaxin4与Munc18c发生解离,引起SNARE复合体的形成,最后促使GLUT4释放以及葡萄糖吸收。为了深入地研究AS160在胰岛素刺激引起的GLUT4转运中的作用,以及寻找参与调节Munc18c/Syntaxin4复合物解离的可能效应蛋白分子,本研究用哺乳细胞内串联亲和纯化(TAP)以及质谱分析技术分离与鉴定重要蛋白复合体,并且对它们的功能进行了深入的研究。
TAP分离纯化后的蛋白经质谱分析鉴定为Munc18c与Syntaxin4和RUVBL2、AS160与14-3-3两个蛋白复合体。其中Munc18c/Syntaxin4这一蛋白复合体在GLUT4转运上膜中发挥重要作用,而14-3-3与AS160之间的相互作用也已报道。用小规模TAP和体内免疫共沉淀(Co-IP)实验进一步证实了RUVBL2与AS160之间的相互作用。在3T3-L1脂肪细胞分化过程中,RUVBL2的内源表达逐步上升,直到分化后的第8天达到最高点,与脂肪细胞分化的步调基本同步。尽管GLUT4也是肌肉细胞中的主要葡萄糖转运蛋白,但是研究表明在骨骼肌肉细胞L6分化前后,RUVBL2的表达水平没有显著变化,这提示RUVBL2可能特异地在3T3-L1脂肪细胞的分化中差异表达。免疫荧光分析表明:3T3-L1细胞分化前后,RUVBL2的亚细胞定位截然不同。在3T3-L1成纤维细胞中,RUVBL2主要分布在细胞核内;在分化后的3T3-L1脂肪细胞中,RUVBL2均匀地分布在整个细胞内,没有典型的细胞核集中分布现象。
为了深入地研究RUVBL2在GLUT4转运、葡萄糖吸收以及脂肪细胞分化中的作用,本研究用RNAi、全内反射荧光显微术(TIRFM)、葡萄糖吸收测定、油红染色等方法获得以下结果:在分化后的3T3-L1脂肪细胞中,RUVBL2的沉默表达明显地降低GLUT4的转运上膜,并且抑制葡萄糖吸收50%左右;RUVBL2的沉默表达显著地抑制3T3-L1脂肪细胞分化。此外,Co-IP实验证实了RUVBL2与ATF2之间的相互作用,提示RUVBL2可能通过与ATF2的相互作用参与调节脂肪细胞的分化。综上所述,以上结果为RUVBL2蛋白在GLUT4转运、葡萄糖吸收以及脂肪细胞分化中的作用提供了强有力的证据,进一步表明RUVBL2在胰岛素作用引起的GLUT4转运上膜以及脂肪细胞分化中发挥重要作用。