研究背景:脆性骨折(fragility fractures)是世界范围内的重大公共卫生问题之一,对社会健康和经济产生了深刻影响。据报道,在美国每年约有2百万例脆性骨折患者,到2025年甚至会增加到3百万例。在过去30年中,髋部骨折的风险相比于以往增加了2-3倍。在脆性骨折中,脊柱的椎体骨折最为常见。而髋部骨折危害性最大,它可以导致30%患者永久致残,80%患者因此丧失独立活动的能力,严重降低了老年人的生存质量。一般来说,骨折导致急性疼痛,几乎所有骨折病人都需要被送往医院接受长期固定治疗,且恢复过程较缓慢。骨折愈合的过程是由多种生长因子及细胞因子紧密配合发挥作用,从而调控活化和细胞增殖。成功愈合骨折的四条件包括适当的机械环境、成骨细胞、骨支架和有效诱导成骨的生长因子。尽管目前为止有很多的策略旨在改善脆性骨折的治疗,以加快骨再生过程,但治疗方案存在很多缺陷。因此我们需要寻找更加有效和实际的骨再生方案。小RNA(microRNA,miRNA)是一类长度大约只有18-25个核苷酸大小的内源性非编码RNA。虽然编码小RNA的基因在大多数生物全基因组中占少数且不直接参与编码蛋白质,但其往往在调节目标基因表达方面起重要作用。众所周知,小RNA可以同时调节多种目标mRNA表达,从而调控包括细胞增殖、分化等一系列细胞功能。另外,大量研究表明microRNA与骨形成有关:静脉注射双链miR-146a对软骨和骨的破坏有明显抑制作用;miR-17-92簇参与对成骨细胞增殖和分化的调控;此外,减少miR-9和miR-181a的表达量可以在促进破骨细胞生存中发挥积极作用;另有研究表明,抑制miR-92a表达可以显著促进血管生成,从而加速年轻小鼠的骨折愈合。鉴于这些发现,我们认为microRNA可能在骨折愈合中起关键作用。miRNA-28-3p和miRNA-28-5p来源于同一个miRNA-28前体的两个臂,但它们的序列不同,靶标的mRNA也不同,所以在同一个生理或病理过程中起的作用也有所不同。例如,miR-28-5p和miR-28-3p在结肠癌标本中的下调对结肠癌细胞有不同的影响。miR-28-5p的过度表达能够抑制结肠癌细胞的体外增殖、迁移和侵袭,而miR-28-3p则促进了结肠癌细胞的体外增殖、迁移和侵袭。另一个例子是miR-28-5p在肝细胞癌中可以通过靶向结合IGF1来参与调节PI3K/AKT信号通路,继而控制肿瘤生长,在肝癌的发展中起抑制作用。既然miR-28-5p与miR-28-3p在调控癌细胞体外增殖方面呈现不同甚至相反影响,我们推断miR-28-3p可能发挥诱导细胞增殖、抑制细胞凋亡的作用。已知miR-28可以通过直接结合Nrf2mRNA的3’非翻译区从而降低乳腺上皮细胞中Nrf2的表达。Nrf2可以抑制细胞生长和控制细胞周期,由此表明它可能对成骨细胞的增殖有促进作用,可以加速骨折愈合的过程,但具体机制尚未阐明,于是我们的研究试图探究此机制。研究目的:本文在之前报导的基础上,拟经过大量实验,解决以下几点问题:miR-28-3p的表达水平在骨折患者的愈合过程中是如何变化的?它是否可以促进成骨细胞的增殖并抑制凋亡?其下游调控靶点及通路是什么?miR-28-3p是如何通过调节下游基因及信号通路加速骨折愈合的?研究方法:我们从随机选取2015年3月到2017年3月期间在我院就诊的20例脆性骨折患者,其中有10例患者为手部骨折(男女各半,平均年龄为24.9±2.08);另外10例患者为关节内骨折(男女各半,平均年龄为24.1 ±2.69)。患者样本为不同时间点采集的血浆样本:创伤后24小时之内取病人血浆样品,分别于标准化固定治疗后的7天、14天、21天取同一患者血浆,同时取10例从未接受过心力衰竭、肾衰竭、关节痛或自身免疫类疾病治疗的健康人群血浆作为正常对照。利用定量RT-PCR方法检测受试人群在骨折愈合不同时期的miR-28-3p表达量,研究其表达量与骨愈合之间的潜在关系。接下来,我们选取了小鼠成骨细胞系MC3T3-E1,分别转染miR-28-3p mimics、ASO-miR-28-3p及其各自空载作为阴性对照,并分别用MTT方法和流式细胞学方法分析了转染前后细胞的增殖和凋亡水平。此外,检测转染细胞中凋亡相关蛋白Bax、Bcl2以及骨生成相关蛋白Collal、Col-Ⅱ、Col-X的表达量。根据TargetScan预测的miR-28-3p和野生型Sox6 3’非编码末端(UTR)的结合位点,将Sox6的3’-UTR片段ACCCTAATCTAGTTGTCAT突变成ACCCTAAACAACTTGTCAT,将野生型或突变型Sox6 3’-UTR克隆到含有荧光酶报告基因载体pmirGLO的下游,将miR-28-3p mimics与野生型Sox6的3’末端共转染到小鼠MC3T3-E1细胞中,72小时后以海肾荧光素酶活性作为内参,计算相对荧光素酶活性值,检测在miR-28-3p mimics存在的情况下能否导致荧光素酶活性的改变。另外还采用定量PCR和westernblot方法进一步探究了miR-28-3p对Sox6表达量的影响。将小鼠Sox6基因的完整cDNA克隆到pcDNA3.1/Zeo载体上,构造出可以过表达Sox6基因的pc-Sox6质粒。miR-28-3pmimics和pc-Sox6共转染进细胞,检测细胞活力、凋亡程度、凋亡相关蛋白表达水平及骨生成相关基因(Colla1、Col-Ⅱ、Col-X)的表达水平变化。我们用mimics阴性对照、miR-28-3p mimics、ASO阴性对照、ASO-miR-28-3p转染细胞,并用PI3K的抑制剂LY294002处理细胞,用免疫印迹的方法分析检测了加入抑制剂前后,参与PI3K/AKT信号通路的蛋白表达和磷酸化水平变化。实验结果:定量PCR结果显示,与正常人群对照组相比,miR-28-3p在骨折患者接受固定化治疗7天后的表达量并没有显著变化;而随着时间推移,在固定化治疗14天和21天时,其表达量有大幅度下调(P<0.05,P<0.01甚至P<0.001)。这说明miR-28-3p在骨折愈合过程中的表达量是明显下调的。与对照组相比,转染miR-28-3p mimics的细胞在转染后1天、2天、3天细胞活力有明显增强(P<0.05或p<0.01),而转染反义寡核苷酸ASO-miR-28-3p的细胞活力降低;相反地,MC3T3-E1细胞凋亡的比率在转染miR-28-3pmimics后明显被抑制(P<0.01),转染ASO-miR-28-3p后细胞凋亡加强。因此可以看出,miR-28-3p对成骨细胞有促增殖、抑凋亡的作用。另外,转染miR-28-3p mimics的细胞中促凋亡基因Bax表达量下调、抗调亡基因Bcl-2上调。Colla1的表达水平也明显增加,但同时也显著降低了 Col-Ⅱ和 Col-X 的表达(P<0.01 或 P<0.001)。而 ASO-miR-28-3p 对 Colla1、Col-Ⅱ、Col-X基因表达水平的影响正好相反(P<0.05,P<0.01或P<0.001)。上述结果表明,miR-28-3p增强细胞活力和Collal基因的表达,同时抑制细胞凋亡和Col-Ⅱ、Col-X 基因表达。野生型Sox6与miR-28-3pmimics共转染可以导致荧光素酶活性大幅度降低,而ASO-miR-28-3p可以显著增加报告基因的荧光素酶活性(P<0.01),即miR-28-3p可以导致Sox6表达量下调;而miR-28-3p mimics共转染不会引起突变型Sox6荧光素酶活性大幅度降低。Sox6在mRNA水平和蛋白水平上的表达量均会由于miR-28-3pmimics的转染而显著减少(P<0.01);而转染ASO-miR-28-3p后Sox6 mRNA和蛋白的表达量明显增加(P<0.05)。综上所述,这说明Sox6可以作为miR-28-3p的靶基因,后者可以通过直接结合来抑制Sox6的表达量。当miR-28-3p单独过表达时,我们观察到MCT3T-E1细胞在转染后1天、2天、3天后的增殖速率与阴性对照组相比明显提升,细胞凋亡率明显降低(P<0.05或P<0.01)。有趣的是当共转染pc-Sox6后,miR-28-3pmimics对细胞增殖、凋亡的影响会降低(P<0.05或P<0.01)。促凋亡因子Bax在miR-28-3p mimics的调控下表达量减少,而抑制凋亡的Bcl-2蛋白表达量上调;作为补充,ASO-miR-28-3p可以使Bax上调并使Bcl-2表达量下调。miR-28-3p对二者的影响均可以被Sox6抑制。与对照组相比,miR-28-3p过表达的MCT3T-E1细胞表达骨生成相关基因(Colla1、Col-Ⅱ、Col-X)能力均有所改变:Collal表达增加(P<0.01);而 Col-Ⅱ 和 Col-X 表达量下调(P<0.05)。同时转染 miR-28-3p mimics和pc-Sox6可以抑制前者对成骨细胞表达上述骨生成相关基因的影响。与对照组相比,miR-28-3pmimics可以上调PI3K和Akt的磷酸化水平;而ASO-miR-28-3p则相反,可以抑制二者的磷酸化。同时,miR-28-3p引起的磷酸化上调可以被PI3K/Akt通路的抑制剂LY294002抑制,表明miR-28-3p可能通过激活PI3K/Akt通路在成骨过程中起作用。实验结论:本研究中对脆性骨折患者血浆的分析表明,在手部和关节内骨折愈合过程中miR-28-3p的表达水平均明显下降。这是由于:在骨折愈合初期,miR-28-3p表达量较高,这时细胞处于快速增殖阶段;随着时间的推移,成骨细胞数量快速增加,这时miR-28-3p有所下降,它调控的细胞增殖速率也随之降低,而其对细胞凋亡的抑制作用也部分被解除,于是成骨细胞总体增殖的速率有所下降;到了骨折愈合的后期,miR-28-3p的含量大幅度下降,导致成骨细胞不再快速分裂增殖,而是进一步分化成为成熟的骨细胞、软骨细胞等。通过转染细胞中凋亡相关蛋白表达量的结果可以进一步验证miR-28-3p mimics能够促进细胞增殖、抑制凋亡,在骨折愈合过程中有潜在的促进作用。另一方面,Col-Ⅱ是软骨细胞分化发育成骨的过程中首先编码的蛋白,之后合成Col-X,而Colla1只有在成骨细胞中才会表达。实验中,Collal的表达水平受miR-28-3p mimics的影响而上调;而Col-Ⅱ和Col-X的表达水平均有所下调,意味着miR-28-3p对骨折愈合有潜在的促进作用。我们证实了参与细胞增殖和凋亡的Sox6转录因子是miR-28-3p的一个下游调控靶基因,它受到miR-28-3p mimics的负向调控。miR-28-3p可以在成骨细胞中通过靶向负面调节Sox6而促进细胞活力、抑制细胞凋亡、影响骨生成相关基因(Colla1、Col-Ⅱ、Col-X)的表达,进而解除了 Sox6对miR-28-3p的负反馈抑制作用。同时,Sox6过表达可以削弱miR-28-3pmimics对细胞活力、细胞凋亡和成骨相关基因表达的影响。最后,miR-28-3p可以通过活化PI3K/AKT信号途径而加速骨折愈合过程。总之,我们的实验探究了 miR-28-3p加速骨折愈合的新功能,其可能的分子机制是miR-28-3p调控其下游靶基因Sox6和PI3K/Akt通路。