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背景当前,在器官移植术后的药物治疗中,免疫抑制状态的控制是一个棘手的问题。常用的免疫抑制剂有化学合成细胞毒类(抗代谢剂和烷化剂)、抗生素类、肾上腺皮质激素类和生物制剂类。其中,抗生素类免疫抑制剂他克莫司主要用于肝、肾移植,具有很强的免疫抑制作用,体外免疫抑制效应为环孢素A的50-100倍,其突出特点为可有效地逆转对环孢素A及糖皮质激素治疗无效的排斥反应。然而,他克莫司的治疗指数低,治疗窗窄,有肾毒性及神经毒性,药物的吸收、代谢等受多个因素的影响,药动学个体间差异大,有必要对使用他克莫司的患者进行治疗药物监测(Therapeutic drug monitoring, TDM)。通过监测全血谷浓度值来调整他克莫司的给药剂量,避免药物过量引起药物毒副作用或剂量不足导致急性排异反应。但是,他克莫司全血谷浓度值不是一个理想的监测指标。他克莫司全血谷浓度与肾毒性等毒副作用的相关性较好,而与药物疗效的相关性较差。近年来在群体药物动力学基础上发展起来的有限采样策略(Limited sampling strategies, LSS)通过检测给药间期2-4个血药浓度,计算药-时曲线下面积(Area under curve, AUC)的方法被认为能更准确地反映患者的药物暴露量,而且AUC值可更准确地预测他克莫司的疗效。值得注意的是,在一个给药间期内多次采集全血增加了患者,尤其是特殊群体(如儿童、老年人)的生理负担,也增加了门诊患者的单次门诊留院时间。另外,移植患者具有各种不同的原发病,生理、病理状态特殊,常合并其他治疗药物,因此对血药浓度检测的要求是样本量少、便捷、准确、特异性高。干血滤纸片(Dried blood spots, DBS)样品收集技术具有全血样品无法比拟的优势,包括样本的常温稳定性更好、微创、成本更低、易保存和运输、减少潜在的病原体感染风险,在干血滤纸片的基础上我们结合液质联用技术的灵敏度高、专属性强的特点,研究建立使用高效液相色谱-串联质谱法(High performance liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry, LC-MS/MS法)检测干血滤纸片样品上他克莫司血药浓度的方法,并对该方法进行了方法学考察及验证。方法实验方法为从DBS样品打孔取下6mm直径的血斑样品,放入2mL普通离心管中,加入含有内标的10%甲醇-水溶液,超声水浴30min,加入特丁基甲醚溶液提取,上清液转移并在45℃温度下氮气吹干,使用50μ L50%甲醇-水溶液(50：50,v/v)重组后取10μL上清液进样。色谱条件：流动相：含0.1%甲酸和2mmol/L醋酸铵的甲醇-水溶液(95：5,v/v),流速：0.3mL/min,使用XBridge Phenyl色谱柱进行色谱分离,柱温：50℃。配备涡流喷雾离子源的API3000型质谱在正离子检出模式和多离子反应监测模式(Multiple reaction monitoring, MRM)下以质荷比m/z821.5/768.4和809.4/756.3分别检测他克莫司和内标子囊霉素。方法学验证包括线性、定量下限、批内/批间精密度与准确度、特异性、提取回收率和介质效应、长期稳定性、滤纸片的色谱效应、全血体积和HCT值对检测结果的影响。采用所建立的干血滤纸片LC-MS/MS法(DBS-LC-MS/MS法)检测来自临床实验室的50个剩余样本的检测,并将检测结果与微粒子捕捉酶免疫法(Microparticle Enzyme-linked Immunoassay, MEIA法)和全血LC-MS/MS法(WB-LC-MS/MS法)的检测结果进行比较,使用统计学软件进行分析并作图。结果在上述的色谱-质谱条件下,他克莫司和内标的保留时间均在1.67min,峰型良好,无杂峰干扰,基线平稳。他克莫司标准曲线线性范围为1～80ng/mL, r=0.998。定量下限和最低检测限分别为1ng/mL和0.25ng/mL.高、中、低浓度质控及定量下限的批内、批间变异均小于15%,他克莫司和内标的提取回收率分别为73.2～79.5%和71.7～77.9%。无明显介质效应。DBS样品稳定性良好,可在室温和4℃下稳定存放至少10天,在50℃下存放至少24h,在-20℃下可存放至少35天。未检测到滤纸片的色谱效应。使用不同体积(15～50μL)的全血滴在滤纸片上或不同HCT值(23.2-48.6%)的全血对检测结果无明显影响。比较DBS-LC-MS/MS法、WB-LC-MS/MS法和MEIA法,通过Passing-Bablok回归分析发现DBS-LC-MS/MS法与WB-LC-MS/MS法的一致性较好,MEIA法与DBS-LC-MS/MS法、WB-LC-MS/MS法之间的一致性均较差。通过Bland-Altman差异图和折叠经验累积分布图(又称山形图)可知DBS-LC-MS/MS法与WB-LC-MS/MS法检测的他克莫司浓度明显低于MEIA法测得值,DBS-LC-MS/MS法比MEIA法低,95%的差异值集中在1.125～9.975ng/mL,DBS-LC-MS/MS法检测的他克莫司浓度与WB-LC-MS/MS法的差异不大,95%的差异值在(-1.125～2.25ng/mL)范围。结论本研究建立的检测干血滤纸片上他克莫司血药浓度的高效液相色谱-串联质谱分析法,灵敏性好,专属性强,滤纸片的色谱效应、血斑负载血量和红细胞压积对检测结果无明显影响,该法检测结果与MEIA法存在差异。滤纸片样本用于血药浓度监测是近年兴起的一个研究热点,本研究对干血滤纸片样本检测方法的验证是以当前对滤纸片样本的性质和特点的认识为基础,存在认识的局限性,将该法推广应用于他克莫司的临床血药浓度检测仍有待临床试验的进一步验证。